李志英，李 洋，郭紅霞

（1．忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000；2．華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海021000）

銀納米簇（AgNCs）是一種新型熒光納米材料，通常在水溶液中以膠體Ag的形態(tài)存在［1］，由幾個或幾十個Ag原子組成，是尺寸介于小分子與納米顆粒之間的分子級團(tuán)聚物［2］。由于其直徑一般小于2nm，接近于電子的費(fèi)米波長，會呈現(xiàn)出與半導(dǎo)體類似的特征，產(chǎn)生能級分離并在一定波長光激發(fā)下發(fā)射熒光［3］。合成的AgNCs在催化、光學(xué)、傳感、食品安全、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景［4］?？兹甘G（Malachite Green，MG）是一種帶有金屬光澤綠色的結(jié)晶體，化學(xué)名稱為四甲基代二氨基三苯甲烷［5］。MG是一種合成的工業(yè)染料，作為殺蟲劑和殺菌劑，廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。我國從2002年5月將MG列入《食品動物禁用的獸藥及化合物清單》［6］中。由于MG的抗菌效果非常好，并且價格低廉，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍有違規(guī)使用的情況發(fā)生［7］。

目前檢測MG的方法有色譜法、分光光度法、拉曼光譜法以及免疫分析法等［8］。本文以AgNO3為原料合成AgNCs，用微波輻射減少了合成AgNCs的時間，雜質(zhì)少、純度高、穩(wěn)定性較強(qiáng)、操作簡便、反應(yīng)速率快?；贛G可使AgNCs熒光猝滅，建立了檢測MG含量的熒光分析新方法，該方法選擇性好，可快速檢測水產(chǎn)品中的MG。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

RF－5301PC熒光分光光度計（日本，島津公司）；UV－2550紫外分光光度計（日本，島津公司）；Tecnai G2F205－TWIN透射電子顯微鏡（美國，F(xiàn)EI公司）。

AgNO3（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；2，4－二羥基苯甲醛溶液（上海弘順生物科技有限公司）；孔雀石綠（MG，沈陽樂衡科技有限公司）；實驗所用其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1．2 實驗方法

1．2．1 AgNCs的制備 取一個潔凈的圓底燒瓶，依次加入2mL 1．0×10－3mol／L聚乙烯亞胺（PEI）溶液，2mL 1．0×10－3mol／L AgNO3溶液，2mL 1．0×10－3mol／L 2，4－二羥基苯甲醛溶液，混合均勻。在功率為260W的微波反應(yīng)器中加熱80s，溶液逐漸由無色變?yōu)榱咙S色。反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫，定容到100mL容量瓶中，避光保存在4℃的冰箱中。

1．2．2 AgNCs對MG的檢測 取兩支潔凈的比色管，分別加入1mL的AgNCs溶液，2mL pH＝5的HAc－NaAc緩沖溶液，然后在其中一支比色管中加入5mL 1．0×10－6mol／L的 MG溶液，再用水定容到10mL。室溫下反應(yīng)20min，用1cm比色皿，在激發(fā)波長為432nm，發(fā)射波長為539nm下測量熒光強(qiáng)度，分別表示為F0、F。其中，F(xiàn)0為AgNCs溶液體系熒光強(qiáng)度；F為AgNCs溶液中加入MG后的熒光強(qiáng)度。計算ΔF（ΔF＝F0－F）。

2 結(jié)果與討論

2．1 AgNCs的表征

圖1曲線1說明AgNO3在432nm激發(fā)波長下，于507nm左右出現(xiàn)較弱的熒光；曲線2說明AgNCs在539nm左右出現(xiàn)較強(qiáng)熒光，曲線3和曲線4說明二羥基苯甲醛和PEI在432nm激發(fā)波長下沒有熒光，此現(xiàn)象證明生成了AgNCs，并且發(fā)射較強(qiáng)的熒光。用普通微柵支持膜浸漬在AgNCs溶液中，放在紅外燈下烘干，重復(fù)此操作數(shù)次，最后將支持膜放在濾紙上等待測樣，用透射電鏡掃描得圖2。圖2表明，合成的AgNCs粒徑分布均勻并基本呈球形，其平均粒徑為1．7～5nm左右。

圖1 AgNCs體系的熒光光譜圖Fig．1 Fluorescence spectra of AgNCs system λex＝432nm，λex＝539nm．

圖2 AgNCs的透射電鏡（TEM）圖Fig．2 TEM image of AgNCs

2．2 還原劑和穩(wěn)定劑的選擇

固定其它因素不變，只改變1．0×10－3mol／L PEI溶液和2，4－二羥基苯甲醛溶液的體積分別為0．5、1、2、3、4、5mL，測定還原劑和穩(wěn)定劑的量對AgNCs熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：還原劑用量為1mL，穩(wěn)定劑用量為2mL時，AgNCs溶液的熒光強(qiáng)度最大。所以本實驗選用2，4－二羥基苯甲醛與AgNO3的最佳配比為1∶1，PEI溶液與AgNO3的最佳配比為2∶1。

2．3 微波輻射時間和功率的影響

固定其它條件不變，只改變微波輻射時間依次為60、80、100、120、140s；固定其它條件不變，只改變功率為65、130、195、260、325W，測定反應(yīng)時間和功率對AgNCs熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：當(dāng)反應(yīng)時間為80s，反應(yīng)功率為260W時，生成AgNCs溶液的熒光強(qiáng)度最大。

2．4 AgNCs穩(wěn)定性實驗及熒光量子產(chǎn)率的計算

固定其他條件不變，只改變溫度、放置時間、光照、pH、氧化還原劑，測定AgNCs的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：溫度與放置時間對AgNCs的穩(wěn)定性幾乎無影響，即AgNCs對溫度不敏感；放置時間對AgNCs的熒光強(qiáng)度沒有影響，光照影響較小。加入配制的體積分?jǐn)?shù)為0．25%的H2O2溶液作為氧化劑，質(zhì)量濃度為30mg／L的Na2SO3溶液作為還原劑，分別測定AgNCs熒光強(qiáng)度的變化。加入H2O2體系熒光強(qiáng)度變化較小，加入Na2SO3溶液的體系熒光增強(qiáng)，30min后穩(wěn)定，說明還原劑對AgNCs的熒光強(qiáng)度有影響。

選取硫酸奎寧作為基準(zhǔn)物質(zhì)，已知其在激發(fā)波長為432nm處的熒光量子產(chǎn)率為0．577。根據(jù)文獻(xiàn)方法［9］，計算得 AgNCs的熒光量子產(chǎn)率為0．445。

2．5 AgNCs對MG的選擇性

取兩支比色管，分別加入1．0×10－3mol／L AgNCs溶液1mL，其中一支加入1．0×10－6mol／L其它物質(zhì)溶液2mL，用水定容到10mL。在激發(fā)波長432nm處，測量熒光強(qiáng)度，分別表示為F0、F，計算ΔF（ΔF＝F0－F），進(jìn)而求出ΔF／F0的比值，如圖3。ΔF／F0值的巨大差異表明了AgNCs對MG具有良好的選擇性。

圖3 AgNCs對不同物質(zhì)的響應(yīng)Fig．3 Response of AgNCs to different compounds

2．6 反應(yīng)機(jī)理

聚乙烯亞胺含有大量氨基，包圍在AgNO3周圍為模板，用2，4－二羥基苯甲醛在微波輻射條件下還原AgNO3為Ag原子，聚集為水溶性AgNCs，在539nm波長處有綠色熒光，而二羥基苯甲醛與PEI發(fā)生交聯(lián)聚合反應(yīng)，生成的交聯(lián)聚合物通過Ph－C＝N作用包圍在AgNCs外層，防止AgNCs團(tuán)聚，并由于保護(hù)劑共軛鏈增加使其熒光增強(qiáng)。MG為三苯甲烷分子，其中的次甲基受三個苯基的影響，有很高的化學(xué)活性，能被金屬原子置換，MG中間的C與部分Ag原子置換，使AgNCs濃度減小，AgNCs熒光強(qiáng)度也隨之降低。據(jù)此，可以實現(xiàn)AgNCs對MG的測定。

2．7 pH對體系的影響

用稀HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)測定體系的pH，研究pH對體系的影響。結(jié)果表明ΔF隨pH的升高先增大后減小，當(dāng)反應(yīng)溶液pH＝5，相對熒光強(qiáng)度ΔF最大，即孔雀石綠對AgNCs的熒光猝滅效果最好。所以本實驗選用pH＝5的HAc－NaAc緩沖體系為反應(yīng)介質(zhì)。

2．8 反應(yīng)時間和溫度對體系的影響

體系在5min后反應(yīng)完全，并且在20min時ΔF最大，以后基本不變，實驗選擇在20min后測定。設(shè)定20℃、30℃、40℃、50℃、60℃不同的溫度進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果表明當(dāng)反應(yīng)溫度為20℃時，ΔF最大，即MG對AgNCs的熒光猝滅效果最好

2．9 工作曲線及檢出限

按實驗方法分別配制濃度為1．0×10－3、1．0×10－4、1．0×10－5、1．0×10－6、1．0×10－7mol／L的 MG標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不加MG溶液作為空白，在激發(fā)波長432nm測定熒光強(qiáng)度。實驗結(jié)果表明：MG在濃度為8．0×10－8～1．2×10－5mol／L成良好的線性關(guān)系，其線性關(guān)系式為：ΔF＝69．04c＋49．50，相關(guān)系數(shù)r＝0．9980。做11次空白試驗，求得其標(biāo)準(zhǔn)偏差（Sb）為1．17%，利用公式3Sb／K求得檢出限為5．0×10－8mol／L。

2．10 干擾離子的測定

對1．0×10－5mol／L MG溶液進(jìn)行測定，在相對誤差≤5%的情況下，共存離子允許的倍數(shù)為：1 000倍的K＋、Na＋、NO3－、SO2－4；500倍的蔗糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、PO3－4、CO2－3；100倍的Ca2＋、Mg2＋、Fe3；50倍的 Mn2＋、Cd2＋、Pb2＋、Hg2＋、Zn2＋；20倍的Cu2＋。實驗前加入EDTA掩蔽部分金屬離子。

2．11 樣品的測定 取草魚、鯉魚、蝦肌肉組織均質(zhì)，準(zhǔn)確稱取5．00g于50mL有蓋離心管中，加入4mL乙腈，再加入5mL KBH4溶液，渦旋振蕩2min，放置10min，期間劇烈振蕩2～3次，每次1min。在離心管中繼續(xù)加入2mL檸檬酸，5mL二氯甲烷，6 000r／min離心5min，收集上層溶液。下層再加入5mL二氯甲烷，劇烈振蕩1min，6 000r／min離心5min，合并二氯甲烷層，此步驟重復(fù)操作一次。合并后的二氯甲烷層加入10mL水，劇烈振蕩1min，6 000r／min離心5min，棄去上層［10］。按1．2．2項下的方法對樣品進(jìn)行測定，結(jié)果如表1。

表1 樣品的測定結(jié)果及回收率（n＝3）Table 1 Determination results of sample and recoveries（n＝3）

3 結(jié)論

本實驗在水溶液中以2，4－二羥基苯甲醛為還原劑，聚乙烯亞胺為穩(wěn)定劑，AgNO3為原料，在微波功率為260W的條件下輻射80s，合成直徑較小的AgNCs。以AgNCs作為熒光探針對水產(chǎn)品中孔雀石綠進(jìn)行檢測，方法檢出限為5．0×10－8mol／L，回收率范圍為97%～103%。