李建達(dá)，于 江，張玉玉，任素芳，陳 蕾，郭立輝，孫文博，陳 智，王 淞1，，劉俊珍，杜以軍，李 俊，楊靈芝，王金寶1，＊，吳家強(qiáng)＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南250100；3.山東濱州沃華生物工程有限公司，濱州256600）

豬鏈球菌2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

李建達(dá)1，2§，于 江2§，張玉玉2，任素芳2，陳 蕾2，郭立輝2，孫文博2，陳 智2，王 淞1，2，劉俊珍2，杜以軍2，李 俊2，楊靈芝3，王金寶1，2＊，吳家強(qiáng)2＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南250100；3.山東濱州沃華生物工程有限公司，濱州256600）

摘 要：試驗(yàn)根據(jù)豬鏈球菌2型莢膜多糖（CPS）抗原設(shè)計(jì)CPS2J基因特異性引物，建立豬鏈球菌2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝－3.073x＋36.87，r＝0.995，熔解曲線只有單一的特異峰。敏感性試驗(yàn)顯示，該方法可以檢測(cè)出模板最低濃度為1.0×101拷貝／μL，是普通PCR的10倍；特異性試驗(yàn)顯示，對(duì)豬鏈球菌2型具有良好的特異性，能夠區(qū)分其他血清型豬鏈球菌和其他細(xì)菌；重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)為0.37%～0.63%，均低于2.5%。臨床檢測(cè)顯示該方法的敏感性明顯高于常規(guī)PCR方法和細(xì)菌分離的方法。以上結(jié)果表明，本研究建立的方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，有利于對(duì)豬鏈球菌2型的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；敏感性；特異性；重復(fù)性

豬鏈球菌（Streptococcussuis）是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病病原菌，臨床上以引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥和突發(fā)死亡等癥狀為主。至今，已鑒定出35個(gè)血清型（1～34型及1／2型）［1］。引起豬發(fā)病的主要血清型是1、2、7、9型，其中2型不僅致病性強(qiáng)，而且流行較為廣泛。1991年中國廣東省首次報(bào)道了豬鏈球菌2型病的發(fā)生；1998—1999年夏季江蘇省部分豬群暴發(fā)此病，嚴(yán)重威脅人畜健康［2］；2005年7月四川資陽暴發(fā)豬鏈球菌2型病并引起人員死亡［3］。目前，常規(guī)的細(xì)菌分離、抗體檢測(cè)不易區(qū)分豬鏈球菌的血清型。普通PCR無法對(duì)病料細(xì)菌進(jìn)行定量檢測(cè)，而且會(huì)出現(xiàn)假陽性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅敏感性高、特異性強(qiáng)、易于操作，而且結(jié)果準(zhǔn)確、直觀，并具有實(shí)時(shí)定量性，已經(jīng)廣泛用于病原微生物的檢測(cè)［4］。莢膜多糖（CPS）是豬鏈球菌的毒力因子［5－6］，CPS對(duì)豬鏈球菌2型的侵襲力有決定性作用，可以在未免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生具有抗吞噬活性的抗體，保護(hù)細(xì)菌不被巨噬細(xì)胞吞噬［7－8］。CPS2J是豬鏈球菌2型CPS中一段高度保守的序列，本試驗(yàn)以CPS2J基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物，建立豬鏈球菌2型SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為實(shí)現(xiàn)對(duì)豬鏈球菌2型的快速診斷和定量分析提供科學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1菌株

豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬傳染性胸膜肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌菌株均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存；馬獸疫鏈球菌菌株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）。

1.2主要試劑及儀器

SYBR?Premix ExTaqTMⅡ、TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNA Marker、pMD18－T載體等均購自寶生物工程（大連）有限公司；Trans－T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)購自Thermo Fisher Scientific公司；Light－Cycler?480Ⅱ購自Roche公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)豬鏈球菌2型莢膜抗原基因簇CPS2J基因（GenBank登錄號(hào)：AF118389）序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：CPS2J（P1）：5′－GAAAAAGTCAGCATTATTGTACCTATT－3′；CPS2J（P2）：5′－CTGAAGAACCGTCATCTATCAAAAG－3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段為124bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4常規(guī)PCR擴(kuò)增

采用直接煮沸法提取豬鏈球菌2型DNA，PCR反應(yīng)體系25μL：10×Buffer（含Mg2＋）2.5μL，dNTP 2μL，上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 16μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，34個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，用5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

1.5.1PCR產(chǎn)物的純化回收及克隆鑒定 將鑒定正確的PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化提取目的片段。將目的片段連接pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化Trans－T1感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基（含Amp，100μg／mL）中培養(yǎng)，而后挑取陽性菌落進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切鑒定，并將陽性質(zhì)粒送于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.5.2重組質(zhì)粒濃度測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備用紫外分光光度計(jì)測(cè)定陽性質(zhì)粒的濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，并將質(zhì)粒濃度稀釋到1.0×1010拷貝／μL，再倍比稀釋至1.0×105拷貝／μL，用以上稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)樣品模板，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

PCR反應(yīng)體系為20μL：SYBR Premix ExTaqⅡ用量范圍為8～12μL，引物范圍為0.5～1μL，模板用量范圍為1～2μL。退火溫度選用范圍為58～60℃。對(duì)SYBR Premix Ex TaqⅡ、引物和模板的濃度進(jìn)行篩選，優(yōu)化反應(yīng)條件。

1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別以1.0×105～1.0×1010拷貝／μL 10倍倍比稀釋的陽性質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得出各自動(dòng)力學(xué)曲線，通過儀器軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8敏感性試驗(yàn)

分別以1.0×100～1.0×107拷貝／μL倍比稀釋的樣品作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)用常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的敏感性。

1.9特異性試驗(yàn)

用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系檢測(cè)豬鏈球菌7型、馬獸疫鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、傳染性胸膜肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌，確定該方法的特異性。

1.10重復(fù)性試驗(yàn)

取1.0×108、1.0×105、1.0×103拷貝／μL的標(biāo)準(zhǔn)樣品，每組重復(fù)3次，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并計(jì)算每個(gè)稀釋度的變異系數(shù)。

1.11臨床樣品檢測(cè)

對(duì)24頭臨床癥狀疑似豬鏈球菌2型的病豬，采集關(guān)節(jié)液、心包液、肺臟、肝臟、心血，分別用細(xì)菌分離培養(yǎng)、常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1目的片段的克隆及鑒定

將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接，獲得重組質(zhì)粒，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，得到一條124bp的條帶（圖1），與目的片段大小一致。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與目的片段序列完全一致。

圖1　PCR擴(kuò)增目的片段Fig.1 PCR amplification of targeted fragment

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

優(yōu)化后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物各1μL，模板2μL，ddH2O 6μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線見圖2。由圖2可知，所有陽性質(zhì)粒只出現(xiàn)一種熒光峰，峰型單一，沒有雜峰，說明引物設(shè)計(jì)合理。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝－3.073x＋36.87，r＝0.995，表明相關(guān)程度極高且呈正相關(guān)。

圖2　熔解曲線Fig.2 Melting curve

圖3　標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve

2.4敏感性試驗(yàn)

將陽性質(zhì)粒依次倍比稀釋作為模板，一般認(rèn)為Ct值＞35時(shí)計(jì)為陰性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果見圖4，常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖5。由圖4可知，此方法可檢測(cè)出模板最低濃度為1.0×101拷貝／μL，而常規(guī)PCR可以檢測(cè)出模板最低濃度為1.0×102拷貝／μL（圖5），說明實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性比常規(guī)PCR高10倍。

2.5特異性試驗(yàn)

以馬獸疫鏈球菌、豬鏈球菌7型、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬傳染性胸膜肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)結(jié)果（Ct值＞35時(shí)，計(jì)為陰性）均為陰性（圖6），表明本試驗(yàn)方法具有較高的特異性。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

由表1可知，1.0×108、1.0×105、1.0×103拷貝／μL的標(biāo)準(zhǔn)樣品的變異系數(shù)分別為0.63%、0.37%和0.59%，均低于2.5%，說明該方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.7臨床樣品檢測(cè)

對(duì)24頭臨床癥狀疑似豬鏈球菌2型的病豬分別進(jìn)行細(xì)菌分離、常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見表2。由表2可知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性高于常規(guī)PCR，且明顯高于細(xì)菌分離方法。所得檢測(cè)結(jié)果經(jīng)國標(biāo)法（GB 19915.7—2005）復(fù)檢，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)與國標(biāo)法的檢測(cè)結(jié)果一致率達(dá)100%。

圖4　實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensibility tests of quantitative Real－time PCR

圖5　常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)Fig.5 Sensibility tests of PCR

圖6　實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)Fig.6 Specialty tests of quantitative Real－time PCR

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 Repeatability test of quantitative Real－time PCR

表2　臨床樣品檢測(cè)Table 2 The test of clinical samples

3 討 論

豬鏈球菌2型是豬鏈球菌中毒力最強(qiáng)、危害最嚴(yán)重、流行最廣泛的血清型之一［9－10］。豬鏈球菌可定植于健康豬的扁桃體內(nèi)，帶菌率高達(dá)42.6%［11］，而隨著豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）和豬圓環(huán)病毒?。≒CV）等免疫抑制性疾病的流行，導(dǎo)致豬鏈球菌2型感染率明顯上升［12－14］。

目前，檢測(cè)該菌的方法主要是細(xì)菌分離鑒定和常規(guī)PCR檢測(cè)，細(xì)菌分離鑒定方法不僅耗時(shí)、易污染，而且不易區(qū)分豬鏈球菌的血清型［14］。常規(guī)PCR方法雖然能夠檢測(cè)出豬鏈球菌2型，具有較高的特異性，但操作時(shí)間長、操作繁瑣、敏感性低，而且存在假陽性的可能［15］。本試驗(yàn)建立了豬鏈球菌2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，不僅操作簡(jiǎn)單快速、不易出現(xiàn)假陽性，而且可以對(duì)樣品進(jìn)行定量分析［16］，對(duì)臨床的診斷和檢測(cè)具有指導(dǎo)性意義。

CPS是唯一被證明的豬鏈球菌2型主要的毒力因子，在細(xì)菌致病過程中起著重要作用，有研究表明，缺失CPS基因的變異株完全喪失毒力，能很快被清除［17－19］。CPS對(duì)豬鏈球菌2型的侵入有決定性作用，可以在未免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生具有抗吞噬活性功能的抗體，保護(hù)細(xì)菌不被吞噬［20］。莢膜的存在降低了豬鏈球菌被吞噬的程度，有研究表明缺失莢膜多糖的菌株疏水性增強(qiáng)，更容易被吞噬［21－22］。CPS2J基因是豬鏈球菌2型莢膜抗原基因簇，序列高度保守，與其他血清型同源性低。本試驗(yàn)選取CPS2J為靶基因設(shè)計(jì)引物，通過構(gòu)建質(zhì)粒，將倍比稀釋的陽性質(zhì)粒作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板，建立了豬鏈球菌2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。利用建立的方法對(duì)其他不同血清型的豬鏈球菌和其他細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，只有豬鏈球菌2型有擴(kuò)增曲線，表明該方法具有較高的特異性；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，3組變異系數(shù)均低于2.5%，說明該方法具有較好的重復(fù)性。該方法可以檢測(cè)出最低濃度為1×101拷貝／μL，敏感性優(yōu)于普通PCR。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)體系，建立了重復(fù)性較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，成功建立了豬鏈球菌2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法有較高的特異性、重復(fù)性和敏感性，對(duì)豬鏈球菌2型的快速檢測(cè)及豬鏈球菌防控有重要意義。

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（責(zé)任編輯 姚倩倩）

中圖分類號(hào)：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3107－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.004

收稿日期：2016－05－18

基金項(xiàng)目：泰山學(xué)者特聘專家工程經(jīng)費(fèi)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAIT）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科技成果培育計(jì)劃（2014CGPY04）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目；山東省自然科學(xué)基金（ZR2015YL078）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金（2015YQN51）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2016B14）

作者簡(jiǎn)介：李建達(dá)（1992－），男，山東濟(jì)南人，碩士生，研究方向：動(dòng)物微生物與免疫學(xué)，E－mail：ljd4453＠163.com于 江（1985－），女，山東萊州人，博士，研究方向：動(dòng)物微生物與免疫學(xué)，E－mail：yujiang＿2213＠163.com李建達(dá)和于江對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)，并列為第一作者

通信作者：＊王金寶（1962－），男，山東昌邑人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物病原學(xué)與免疫學(xué)，E－mail：wangjb＠saas.ac.cn吳家強(qiáng)（1975－），男，山東諸城人，博士，研究員，研究方向：動(dòng)物病原學(xué)與免疫學(xué)，E－mail：wujiaqiang2000＠sina.com

Establishment and Application of Quantitative Real－time PCR Method to DetectStreptococcussuisSerotype 2

LI Jian－da1，2§，YU Jiang2§，ZHANG Yu－yu2，REN Su－fang2.CHEN Lei2，GUO Li－h(huán)ui2，SUN Wen－bo2，CHEN Zhi2，WANG Song1，2，LIU Jun－zhen3，DU Yi－jun2，LI Jun2，YANG Ling－zhi3，WANG Jin－bao1，2＊，WU Jia－qiang2＊
（1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China；2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100，China；3.WohuaBiotechCo.，Ltd.，Binzhou256600，China）

Abstract：In this study，aquantitative Real－time PCR method using the specific primers according toCPS2Jgene was established to detectStreptococcussuisserotype 2.The result showed that the equation of standard curve was y＝－3.073x＋36.87，r＝0.995，which demonstrated that the assay had good linear relationship.The melting curve analysis showed that there was only specific peak.Sensitivity test showed that the method could detect the template at the lowest concentration of 1.0×101copies／μL，which was 10times higher than the ordinary PCR.The specific tests showed that this method could able to detectStreptococcussuisserotype 2specially and had nocross－reaction with other serotypes or other bacteria from swine.The CV of repeatability test was 0.37%to 0.63%，lower than 2.5%.The clinical diagnosis showed this assay was more sensitive than ordinary PCR and bacteria isolation.All the results showed that the established method was sensitive，specific and reproducible，which could be used for the rapid diagnosis and quantitative detection ofStreptococcussuisserotype 2.

Key words：Streptococcussuisserotype 2；quantitative Real－time PCR；sensibility；specificity；repeatability