王 景，蔡雪峰

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協和醫(yī)院西院，湖北 武漢 430056）

正交設計法優(yōu)化赤靈芝中堿溶性純化多糖的提取工藝

王 景，蔡雪峰*

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協和醫(yī)院西院，湖北 武漢 430056）

以赤靈芝為原料提取堿溶性多糖，考察了提取時間、提取溫度、液料比、NaOH濃度及提取次數對堿溶性多糖提取率的影響，并采用正交設計試驗，確定了赤靈芝中堿溶性多糖最佳提取工藝參數，即提取時間2 h，提取溫度60 ℃，液料比15 mL/g，NaOH質量濃度5%以及提取次數3次。驗證性試驗中實際測得堿溶性多糖平均提取率為10.98%，證明該優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠，切實可行。

赤靈芝；正交設計試驗；堿溶性純化多糖；提取工藝

赤靈芝(Ganoderma lucidum)屬擔子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)靈芝科(Ganodermatcet)靈芝屬(Ganoderma)，是一種珍貴的藥、食兩用高等真菌[1]，具有扶正固本、抗腫瘤、免疫活性、滋補強壯、抗放射之功效[2]。研究表明[3]，赤靈芝含有多糖、蛋白質、氨基酸、多肽、萜類、甾類、生物堿、有機酸揮發(fā)油、多種酶、鏈烷烴以及和油脂等。其中靈芝多糖是靈芝中主要有效成分之一，藥理研究表明[4-5]，堿溶性多糖具有良好的體外抑制腫瘤細胞生長作用，為了提高赤靈芝堿溶性多糖的提取率，本文采用正交設計試驗，對其提取工藝進行優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤靈芝購自山東泰安；NaOH、無水乙醇、苯酚、濃H2SO4均為分析純。Seven Compact S220多參數測定儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Inifnite M200 Pro酶標儀，Tecan Austria Gmbh；DHG-9246A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；BZFS-02型萬能高速粉碎機，西安寶正實業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿溶性多糖的提取

先將赤靈芝子實體置于50℃烘箱中烘干，粉碎過2號篩，95%乙醇超聲脫脂3次，棄去濾液，殘渣置于50℃烘箱中烘干，超微粉碎，過200目篩，得赤靈芝子實體粉。稱取5 g，按一定條件（提取時間、提取溫度、液料比、堿濃度和提取次數）進行提取，離心，濾液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 堿溶性多糖的純化

采用Sevage法脫蛋白[6]，脫蛋白多糖溶液加入適量無水乙醇，使乙醇終濃度為30%，置4℃冰箱中沉淀過夜，5000 r/min離心15 min，棄去沉淀，上清液再加入無水乙醇使乙醇終濃度為70%，置4℃冰箱中沉淀過夜，5000 r/min離心15 min，棄去上清液，所得沉淀經真空干燥既得赤靈芝堿溶性純化多糖。

1.2.3 葡萄糖標準曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖100 mg，置于250 mL容量瓶中， 加蒸餾水使溶解并定容至刻度，搖勻即得濃度為0.40 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。分別精密量取標準溶液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL置于具塞試管中，分別加蒸餾水至2.0mL，另取蒸餾水2.0mL作為空白對照，各加5%苯酚（重蒸）溶液1.0mL，搖勻，再各加濃硫酸5.0 mL，迅速搖勻，于室溫下放置30 min，于波長490 nm下測定吸光度。以吸光度（A）對葡萄糖溶液濃度（C）作回歸處理，得回歸方程：A=9.527C+0.0065，R2=0.9993，具有良好的線性相關。

1.2.4 堿溶性多糖提取率（%）的測定

稱取20 mg干燥的赤靈芝純化多糖樣品， 溶于適量熱蒸餾水中，冷至室溫后定容至250 mL，用硫酸-苯酚法[7]測定多糖含量。多糖提取率計算公式為（%）=所測多糖含量（g）×100%/供試赤靈芝子實體粉重量（g）。

1.2.5 單因素試驗

在固定其他條件不變的基礎上，分別考察提取時間(X1)、提取溫度(X2)、液料比(X3)、堿濃度(X4)和提取次數(X5)對赤靈芝堿溶性多糖提取率的影響，每組試驗重復3 次。

1.2.6 正交設計試驗

以提取時間、提取溫度、液料比、堿濃度和提取次數為試驗因素，根據單因素試驗結果設計一個5因素4水平試驗16次的正交設計試驗，即L16(45)設計表，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對堿溶性多糖提取率的影響

在試驗條件為提取溫度60℃、液料比20 mL/g、NaOH濃度5%、提取次數1次的條件下，提取時間分別選擇為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h進行試驗，結果表明，先是隨著提取時間的增加，堿溶性多糖的提取率不斷提高，但2 h之后，隨著時間增加反而呈現下降趨勢，因此確定提取時間為2 h。

2.1.2 提取溫度對堿溶性多糖提取率的影響

在試驗條件為提取時間2 h、液料比20 mL/g、NaOH濃度5%、提取次數1次的條件下，提取溫度分別選擇為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃進行試驗，結果表明，一開始隨著提取溫度的升高多糖提取率顯著增加，當溫度超過60℃時，由于高溫條件下會導致部分多糖水解，從而導致多糖提取率明顯降低，因此確定提取溫度為60℃。

2.1.3 液料比對堿溶性多糖提取率的影響

在試驗條件為提取溫度60℃、提取時間2 h、NaOH濃度5%、提取次數1次的條件下，液料比分別選擇為10 mL/g、15 mL/g、20 mL/g、25 mL/g、30 mL/g、35 mL/g進行試驗，結果表明，隨著液料比增大，多糖提取率先是也隨之增大，但當液料比增到20 mL/g后，提取率趨于穩(wěn)定，所以確定液料比為20 mL/g。

2.1.4 堿濃度對堿溶性多糖提取率的影響

在試驗條件為提取溫度60℃、提取時間2 h、液料比20 mL/g、提取次數1次的條件下，NaOH濃度分別選擇為1%、3%、5%、7%、9%、11%進行試驗，結果表明，隨著NaOH濃度的增大，堿溶性多糖的提取率不斷地增大，但當NaOH 濃度超過5%時，由于部分多糖堿水解程度加劇，導致提取率顯著降低，因此確定NaOH濃度為5%。

2.1.5 提取次數對堿溶性多糖提取率的影響

在試驗條件為提取溫度60℃、提取時間2 h、液料比20 mL/g、NaOH濃度5%的條件下，提取次數分別選擇為1、2、3、4、5、6次進行試驗，結果表明，堿溶性多糖的提取率隨著提取次數的增加而增加，當提取次數超過3次后，提取率變化基本趨于穩(wěn)定，故提取次數選擇為3次。

2.2 正交設計試驗結果與方差分析

L16(45)正交設計試驗及方差分析結果見表2、表3。

由直觀分析表2顯示，各因素水平提取率均值最大值分別為：X1、X2和X3均為均值2，X4和X5均為均值3，即赤靈芝堿溶性多糖經過正交設計試驗優(yōu)化的最佳提取工藝為提取時間2 h，提取溫度60℃，液料比15 mL/g，堿濃度5%和提取次數3次。極差大小順序為：X1＞X2＞X5＞X4＞X3，表明各因素對多糖提取率的影響程度大小為提取時間最大，液料比最小，因此在提取過程中我們要嚴格控制好提取時間和溫度。

由方差分析表3我們也可以看出，各因素的F值大小順序為：X1＞X2＞X5＞X4＞X3，結果反映的各因素對多糖提取率影響程度大小順序與直觀分析表結果一致，同時提取時間對提取率的影響具有顯著性差異(P＜0.05)。

表2 正交設計試驗結果直觀分析

表3 方差分析結果

2.3 驗證性試驗

為驗證正交設計試驗優(yōu)化結果，以單因素試驗確定的最佳水平組合為對照作驗證性試驗，試驗重復3次。試驗結果見表4。

表4 驗證性試驗結果(n=3)

由表4可看出，單因素試驗和正交設計試驗所確定的最佳提取工藝唯一的區(qū)別在于液料比的不同，從多糖提取率平均值比較，二者沒有顯著性差異，并且考慮到節(jié)約溶劑和能源，縮短濃縮時間，RSD值也較小，說明正交設計試驗優(yōu)化的赤靈芝堿溶性多糖提取工藝是穩(wěn)定高效的，對生產具有一定的指導意義。

3 結論

本研究利用單因素試驗和正交設計試驗，分別考察了提取時間、提取溫度、液料比、堿濃度和提取次數對赤靈芝堿溶性多糖提取率的影響，試驗結果表明，提取時間對堿溶性多糖提取率具有顯著影響(P＜0.05)，然后從大到小依次是提取溫度，提取次數，NaOH濃度和水料比。

通過正交設計試驗確定的赤靈芝堿溶性多糖最佳提取工藝是提取時間2 h，提取溫度60℃，液料比15 mL/g，堿濃度5%和提取次數3次，驗證性試驗表明，該工藝條件穩(wěn)定性更好，赤靈芝子實體堿溶性多糖提取率高達10.98%，與單因素試驗結果基本一致，且更節(jié)約能源。因此，正交設計試驗用于優(yōu)化赤靈芝堿溶性多糖提取工藝是穩(wěn)定可靠、切實可行的，可用于生產預測。

[1] 黃芳,蒙義丈.活性多糖的研究進展[J].天然產物研究與開發(fā),1999,11(5):90-98.

[2] 寧安紅,孫曉東,曹婧,等.靈芝多糖抗腫瘤作用的初步探討[J].中國微生態(tài)學雜志,2003,15(6):122-116.

[3] 鄭靜,韓宏義,常乃濤,等.靈芝多糖提取及性質分析[J].北方園藝,2011,(06):43-45.

[4] 陳書明,聶向庭,王勤.人工培養(yǎng)靈芝菌絲體中免疫活性成分初探[J].山西農業(yè)大學學報,1994,14(4):429.

[5] 黃偉光,戴文英.靈芝菌的藥效[J].中國食用菌,1993,12(3):15.

[6] 張立娟,于國萍.黑木耳多糖酶法提取條件的優(yōu)化及脫蛋白工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2005,26(5):109-111.

[7] 李剛.發(fā)酵靈芝菌粉和靈芝子實體中靈芝多糖含量比較[J].中國食用菌.1999,19(1):35-36.

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ISSN.2095-6681.2016.03.0183.02