張 徐， 方吉雷， 葛 青,2,3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

梔子黃色素純化工藝的優(yōu)化

張 徐1， 方吉雷1， 葛 青1,2,3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

為了提高梔子黃色素品質(zhì)和提升產(chǎn)品附加值，采用超聲輔助有機溶液熱回流萃取法制備梔子黃色素，采用大孔樹脂分離法分離純化梔子黃色素。實驗結(jié)果表明，梔子黃色素的最佳提取條件為60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，1∶10料液比，60 ℃超聲反應(yīng)30 min，提取2次；梔子黃色素的最佳純化條件為用25%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫大孔樹脂吸附的雜質(zhì)、梔子苷、綠原酸，用80%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液分離梔子黃色素，經(jīng)純化得到的梔子黃色素色價大于320，OD值小于0.2。

梔子黃色素；純化工藝；大孔樹脂

梔子是中國一種常見的景觀植物，也是藥食兼具植物。因產(chǎn)地不同，其成熟果實含有3%～8%的梔子黃色素，梔子黃色素作為一種天然色素具有十分廣闊的應(yīng)用前景[1-8]。梔子的化學(xué)成分很復(fù)雜，有效成分為環(huán)烯醚萜類化合物[9-11]。粗品的梔子黃色素色價較低、雜質(zhì)含量高，有特殊的異味。此外，粗品中含有較多的梔子苷成分，可以與含氨基酸類的物質(zhì)發(fā)生顯色反應(yīng)，生成梔子藍(lán)色素，從而導(dǎo)致梔子黃色素發(fā)生綠變現(xiàn)象，以致嚴(yán)重影響了梔子黃色素的應(yīng)用，因此，實際生產(chǎn)中迫切需要高質(zhì)量的梔子黃色素[12-13]。有實驗證實，當(dāng)OD值(梔子黃色素在238 nm處的吸光度比在440 nm處的吸光度)低于0.4時，可以防止綠變現(xiàn)象的發(fā)生[14-15]。

傳統(tǒng)的精制梔子黃色素的方法有溶劑回流法、酸堿沉淀法、酶法、超濾法和大孔樹脂法等。其中，溶劑回流法成本低、操作簡單，是生產(chǎn)梔子黃色素的主要方法，但用此方法會產(chǎn)生大量的梔子廢液，有機溶劑大量殘留，結(jié)果是既污染了環(huán)境又增加了生產(chǎn)的成本[16-17]。大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一類新型不含交換基團的有機非離子高聚物吸附劑,有較大的孔徑與比表面積,并且大孔樹脂內(nèi)部具有特定的空間立體孔結(jié)構(gòu)，使得大孔樹脂可以有選擇地吸附溶液中有機物質(zhì)。它具有理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及各種有機溶劑，且不受無機鹽類及低分子化合物的影響，可再生利用等優(yōu)點。如今，大孔樹脂在天然產(chǎn)物有效成分的分離、純化領(lǐng)域已經(jīng)有了越來越廣泛的應(yīng)用[18-21]。然而，不同類型的大孔樹脂在極性、適用pH范圍和內(nèi)部結(jié)構(gòu)上有差異，因此，對特定物質(zhì)的分離、純化需選配合適的大孔樹脂[22-24]。本實驗通過比較，選出適合梔子黃色素分離、純化的大孔樹脂，并探索其最佳純化工藝。

1 材料、試劑及儀器

梔子干果，購自江蘇亞邦藥業(yè)股份有限公司。大孔樹脂，上海長哲生物科技有限公司；乙醇AR級，成都市科龍化工試劑廠；KQ-300E超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；TG18K-離心機，深圳市東旺機械設(shè)備有限公司UV-5500pc紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；PHS-3C酸度計，杭州齊威儀器有限公司；TS-1102恒溫?fù)u床，上海天呈實驗儀器制造有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子黃色素粗品的制備

本實驗采用有機溶劑熱回流萃取法制備梔子黃色素粗品。稱取100 g梔子果研磨過60目分子篩，按1∶10的料液比加60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，超聲清洗機溫度設(shè)置60 ℃，超聲30 min后過濾，按相同條件對濾渣重復(fù)提取1次；合并2次的濾液，6 000 r/min條件下離心5 min，離心后的溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，通過真空冷凍干燥后得到梔子黃色素粗品。實驗制得的梔子黃色素粗品色價約為92，OD值為1.25左右。

2.2 大孔樹脂的篩選

為了得到品質(zhì)較好的梔子黃色素，需要將制得的梔子黃色素粗品去雜質(zhì)、純化。本實驗選取AB-8、HDP-300、HDP-500、D-101、X-5型大孔樹脂進行實驗，通過對比不同大孔樹脂對綠原酸和梔子黃色素的吸附率與解析率，篩選性能較好的大孔樹脂。由于制得的粗品成分相對復(fù)雜，因此，吸附率與解析率用吸光度來表征。

2.2.1 不同大孔樹脂的靜態(tài)吸附率和解析率

精確稱取0.1 g梔子黃色素粗品，用去離子水定容至1 000 mL容量瓶中。采用全波長掃描方式，記錄其在440、320 nm處的吸光度值A(chǔ)0。精確稱取不同大孔樹脂2.0 g置于250 mL的錐形瓶中，加入梔子黃色素粗品溶液100 mL；在25 ℃、170 r/min的搖床中吸附24 h后，測定每組溶液在440、320 nm處的吸光值A(chǔ)1。計算靜態(tài)吸附率(Q)，1/g。

靜態(tài)吸附結(jié)束后溶液過濾，用去離子水充分淋洗各組大孔樹脂，然后用濾紙吸干大孔樹脂，將大孔樹脂轉(zhuǎn)移到250 mL的錐形瓶中，加入70 mL的95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，放入25 ℃、170 r/min的搖床中，24 h后測定其吸光度值A(chǔ)2。計算靜態(tài)解析率(D)，1/g。

2.2.2 不同大孔樹脂的動態(tài)解析率

靜態(tài)吸附結(jié)束后溶液過濾，用去離子水充分淋洗各組大孔樹脂，然后用濾紙吸干大孔樹脂，將大孔樹脂轉(zhuǎn)移到250 mL的錐形瓶中，加入70 mL的95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，放入25 ℃、170 r/min的搖床中，每0.5 h取樣一次,記吸光度值為An，測定上清液在440、320 nm處的吸光值。計算解析率Dn,1/g。

2.2.3 不同大孔樹脂的吸附率與解析率比較

不同大孔樹脂對梔子黃色素及綠原酸的靜態(tài)吸附率和解析率見表1，不同大孔樹脂對梔子黃色素及綠原酸的動態(tài)吸附率和解析率見圖1、圖2。

表1 梔子黃色素及綠原酸的靜態(tài)吸附率與解析率Table 1 Rate of static adsorption and resolution of chlorogenic acid and gardenia yellow pigment %

圖1 不同大孔樹脂對梔子黃色素動態(tài)解析率的影響Fig.1 Effects of different resin on dynamic resolution of gardenia yellow pigment

圖2 不同大孔樹脂對綠原酸的動態(tài)解析率的影響Fig.2 Effects of different resin on dynamic resolution of chlorogenic acid

梔子黃色素中主要成分是藏花素和藏花酸，它們易溶于水、乙醇和丙二醇等極性溶劑，不溶于油脂，難溶于苯、汽油等非極性溶劑。結(jié)合表1和圖1、圖2可以發(fā)現(xiàn)：AB-8、HDP-300、HDP-100、D-101、X-5對梔子黃色素和綠原酸均有較強的吸附和解析能力，其中，HDP-300大孔樹脂的吸附和解析能力均優(yōu)于其他4種類型的樹脂。這是由于HDP-300和AB-8大孔樹脂為弱極性大孔樹脂，X-8、D-101和HDP-300大孔樹脂是非極性樹脂；HDP-300大孔樹脂有較好的空間結(jié)構(gòu)。因此，選取HDP-300大孔樹脂對梔子黃色素粗品進行純化。

2.3 制備梔子黃色素純品

2.3.1 大孔樹脂的預(yù)處理

用兩倍體積95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液浸泡大孔樹脂24 h，除去大孔樹脂中可能含有的致孔劑、引發(fā)劑、分散劑等，同時，也使大孔樹脂充分溶脹。然后，將大孔樹脂采用濕法填柱(24 cm×45 cm)，用去離子水以每小時2倍柱體積的洗脫速率清洗大孔樹脂柱，至流出液無醇味即可認(rèn)為洗脫完成，去離子水浸泡24 h備用。

2.3.2 大孔樹脂吸附的雜質(zhì)、綠原酸、梔子苷的洗脫

將梔子黃色素粗品制成濃溶液并吸附于填料柱中。待大孔樹脂柱吸附飽和后，用3倍柱體積的去離子水洗脫吸附了梔子黃色素粗品的大孔樹脂，除去大孔樹脂吸附的雜質(zhì)，去離子水洗脫后全波長結(jié)果見圖3。利用低于30%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫，可以洗脫出梔子黃色素粗品中含有的梔子苷和綠原酸，而僅有少量的梔子黃色素被洗出。高于30%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液則會洗脫出較多的梔子黃色素。因此，本實驗對比了體積分?jǐn)?shù)為20%、25%、30%乙醇溶液的洗脫效果。不同低體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫結(jié)果見圖4。

圖3 去離子水洗脫后全波長掃描Fig.3 Wavelength scanning after demonized water elution

圖4 不同低體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液洗脫結(jié)果Fig.4 Result of different low concentration ethanol solution elution

由圖3可以發(fā)現(xiàn)，用去離子水洗脫吸附飽和的大孔樹脂，可以洗脫出樹脂吸附的雜質(zhì)，并且梔子苷和綠原酸都有部分被洗脫出，而梔子黃色素幾乎沒有被洗脫出。由圖4中20%、25%、30%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液的洗脫結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，綠原酸和梔子苷的洗出率均上升，但用30%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫時，有較多的梔子黃色素也被洗脫，因此，本實驗選取25%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液多次洗脫以除去粗品中的綠原酸與梔子苷。

2.3.3 大孔樹脂吸附梔子黃色素的洗脫

用25%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液多次洗滌除去梔子苷和綠原酸后，分別配制50%、60%、70%、80%、90%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，選取出洗脫梔子黃色素的最佳條件。收集不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的洗脫液，對不同洗脫液在200 ～800 nm進行全波長掃描，記錄特定波長處的吸光度值和全波長掃描的峰型，從而得出最佳的洗脫條件。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫梔子黃色素的全波長掃描結(jié)果見圖5～8。

圖5 50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫后全波長掃描Fig.5 Full wavelength scanning after 50% ethanol solution elution

圖6 60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫后全波長掃描Fig.6 Full wavelength scanning after 60% ethanol solution elution

圖7 70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫后全波長掃描Fig.7 Full wavelength scanning after 70% ethanol solution elution

圖8 80%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫后全波長掃描Fig.8 Full wavelength scanning after 80% ethanol solution elution

結(jié)合圖5～8，對比體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%的乙醇溶液洗脫效果可以發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，掃描峰變高且變窄，這說明洗脫出的梔子黃色素品質(zhì)更高。其中，體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液洗脫效果明顯優(yōu)于體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%的乙醇溶液。因此，本實驗確定的最佳純化條件為用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液洗脫。

2.4 梔子黃色素色價和OD值的測定

梔子黃色素OD值為238 nm和440 nm處吸光度的比值。

利用HDP-300型大孔樹脂純化分離后梔子黃色素的色價大于320，OD值小于0.2，實驗制得的梔子黃色素粗品色價約為92，OD值為1.25左右，因此，利用大孔樹脂吸附法可以大大地提高梔子黃色素的品質(zhì)。

3 結(jié) 語

本實驗利用自制的梔子黃色素，選取5種大孔樹脂，以大孔樹脂對梔子苷、綠原酸、梔子黃色素的吸附率與解析率為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定了HDP-300大孔樹脂作為純化梔子黃色素的大孔樹脂；考察了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的洗脫效果，確定用體積分?jǐn)?shù)為25%的乙醇溶液通過多次洗脫除去梔子黃色素粗品中吸附的雜質(zhì)、綠原酸和梔子苷，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液來洗脫梔子黃色素，得到了色價大于320、OD值小于0.2的梔子黃色素。

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Optimization of purification technology of gardenia yellow pigment

ZHANG Xu1, FANG Jilei1, GE Qing1,2,3

(1.School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023, China;2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Produce,Hangzhou 310023, China;3.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources, Hangzhou 310023, China)

To improve the quality of the gardenia yellow pigment and improve the product added value, organic solvent extraction with ultrasonic-assisted was used to obtain gardenia yellow pigment, and macroporous resin adsorption method was used to purify gardenia yellow pigment. The results show that the optimal conditions of extraction are that solid to liquid ratio 1∶10, the concentration of ethanol 60%, extraction temperature of 70 ℃,extraction time of 30 min, extraction twice. And the optimal conditions of purification are using 25% ethanol eluting macroporous resin adsorption solution to elute impurities, chlorogenic acid and gardenoside; using 80% ethanol solution to separate gardenia yellow pigment. As a result, the color scale of gardenia yellow pigment is more than 320, OD value is less than 0.2.

gardenia yellow pigment; purification technology; macroporous resin

10.3969/j.issn.1671-8798.2016.06.008

2016-09-30

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2011BAD23B02)

張 徐(1990— )，男，江蘇省沭陽人，碩士研究生，研究方向為生物質(zhì)資源利用及工程。

TS264.4；R284.2

A

1671-8798(2016)06-0456-06