朱程芬邱曉曉帥 軍程 涇程 蕾朱長(zhǎng)玲

補(bǔ)腎益沖抗衰湯對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能下降大鼠血清AMH和INHB的影響

朱程芬1邱曉曉1帥 軍2程 涇1程 蕾1朱長(zhǎng)玲2

目的觀察補(bǔ)腎益沖抗衰湯對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能下降模型大鼠血清內(nèi)分泌及抗苗勒管激素（AMH）、抑制素B（INHB）的影響。方法選取40只8周齡雌性SD大鼠，分為正常對(duì)照組、模型組、補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組，各10只，除正常對(duì)照組外，其余各組采用雷公藤多苷片+相應(yīng)藥物制作卵巢儲(chǔ)備功能下降大鼠模型。通過(guò)陰道涂片觀察各組大鼠動(dòng)情周期，光鏡下觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)變化，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、AMH、INHB水平。結(jié)果補(bǔ)腎益沖抗衰湯能維持大鼠動(dòng)情周期4～5天，促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟、改善內(nèi)分泌水平，與模型組比較，E2上升[（21.51±1.26）pg/mL比（9.81±1.18）pg/mL，P＜0.05]，F(xiàn)SH下降[（6.57±1.88）mIU/ mL比（9.59±2.17）mIU/mL，P＜0.05]，F(xiàn)SH/LH降低[（2.27±0.44）比（3.36±0.82），P＜0.05]；升高AMH[（114.45±11.11）ng/L比（100.27±9.17）ng/L，P＜0.05]和INHB[（56.91±1.74）ng/L比（26.28±6.19）ng/L，P＜0.05]水平。結(jié)論補(bǔ)腎益沖抗衰湯能夠改善卵巢儲(chǔ)備功能下降（DOR）大鼠性激素水平，升高AMH、INHB水平，并減少閉鎖卵泡，改善大鼠卵巢儲(chǔ)備功能。

大鼠；卵巢儲(chǔ)備功能下降；補(bǔ)腎益沖抗衰湯；抗苗勒管激素；抑制素B

卵巢儲(chǔ)備功能下降（DOR）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)并命名的女性生殖內(nèi)分泌疾病，是指卵巢卵泡池內(nèi)可募集卵泡數(shù)目減少，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，導(dǎo)致女性生育能力降低及性激素缺乏。因DOR可進(jìn)一步發(fā)展為卵巢早衰（POF）,故早期診斷并給予合理的治療，可使卵巢儲(chǔ)備功能得到改善，提高妊娠率，延緩卵巢早衰[1]。近年研究顯示，血清基礎(chǔ)AMH和INHB水平與卵巢儲(chǔ)備功能密切相關(guān)，是目前有價(jià)值的預(yù)測(cè)DOR指標(biāo)[2]。中醫(yī)雖無(wú)DOR的病名，但根據(jù)癥狀，該病屬中醫(yī)“閉經(jīng)”、“血枯”、“不孕”、“斷經(jīng)前后諸癥”等范疇，病因病機(jī)為腎虛夾瘀、火、痰等本虛標(biāo)實(shí)。補(bǔ)腎益沖抗衰湯是程涇教授治療卵巢儲(chǔ)備功能下降的經(jīng)驗(yàn)方，筆者制作了DOR大鼠模型對(duì)比分析該方對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能下降大鼠血清AMH、INHB等水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性SD大鼠40只，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙2010-0150）體質(zhì)量170～220g，SPF級(jí)，8周齡,溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)。于溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)區(qū)飼養(yǎng)。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲水，自由飲食，常規(guī)全價(jià)飼料喂養(yǎng)，室溫20～22℃，通過(guò)自動(dòng)換氣裝置調(diào)節(jié)室內(nèi)空氣，人工調(diào)節(jié)熒光照明，每天明暗各12h。

1.2 藥品與試劑 雷公藤多苷片（普洛康裕）：10mg/片。補(bǔ)腎益沖抗衰湯（由溫州中山醫(yī)院提供、制備）：由菟絲子、淫羊藿、巴戟天、龜甲、太子參、當(dāng)歸、熟地枸杞子、鹿角片、牛膝、丹參、靈芝、懷山藥、茺蔚子、知母、黃柏等組成。每毫升含生藥1g。黃體酮膠囊（愛(ài)生藥業(yè)）：100mg/粒。補(bǔ)佳樂(lè)（拜耳醫(yī)藥）：1mg/片。左歸丸（宛西制藥）：45g/瓶。AMH、INHB ELISA試劑盒：購(gòu)自R&D公司,批號(hào)E-30082；E2酶免試劑盒：美國(guó)R&D公司，批號(hào)E-30606；LH酶免試劑盒：美國(guó)R&D公司，批號(hào)E-30621；FSH酶免試劑盒：美國(guó)R&D公司，批號(hào)E-30595。

1.3 動(dòng)物分組與給藥 健康雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行陰道細(xì)胞學(xué)涂片，篩選出有正常動(dòng)情周期的大鼠40只，數(shù)字隨機(jī)表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只，9時(shí)/16時(shí)均予生理鹽水；模型組10只，9時(shí)予雷公藤多苷片50mg/kg，16時(shí)予生理鹽水；補(bǔ)佳樂(lè)組10只，9時(shí)予雷公藤多苷片50mg/kg，補(bǔ)佳樂(lè)0.24mg（/kg·d），第4天加用黃體酮膠囊25mg（/kg· d），兩藥同時(shí)停用1天后重復(fù)下個(gè)療程；補(bǔ)腎益沖抗衰湯組10只，9時(shí)予雷公藤多苷片50mg/kg，補(bǔ)腎益沖抗衰湯48mg/（kg·d）；各組均連續(xù)給藥3周。

1.4 標(biāo)本制備與指標(biāo)檢測(cè) （1）用藥結(jié)束后連續(xù)5天陰道涂片：將生理鹽水浸濕的棉簽輕輕插入大鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)后取出、涂片，置于95%乙醇固定20min 后HE染色，光鏡下觀察陰道上皮脫落細(xì)胞變化情況，觀察動(dòng)情周期變化。（2）將處于動(dòng)情前期或第5天尚未出現(xiàn)明顯動(dòng)情周期的大鼠快速處死，心臟取血3mL，置于PE管中，3000r/min離心10min，分離血清，-20℃保存，ELISA法檢測(cè)性激素FSH、LH、E2及血清AMH、INHB。（3）快速取出雙側(cè)卵巢并剔除脂肪組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。HE染色，光鏡下觀察各級(jí)卵泡、黃體、顆粒細(xì)胞（GC）、間質(zhì)等變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）、Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者采用Dunnet，sT3檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠動(dòng)情周期的影響 正常對(duì)照組大鼠維持原有的動(dòng)情周期4～5天。模型組大鼠動(dòng)情周期在給藥1周后延長(zhǎng)為7～8天1次，間情期3～5天。每天1次陰道脫落細(xì)胞涂片觀察，不見(jiàn)動(dòng)情前期。補(bǔ)佳樂(lè)組大鼠性周期不規(guī)則，動(dòng)情前期、動(dòng)情期稍延長(zhǎng)2～5天，或持續(xù)為動(dòng)情前期、動(dòng)情期。補(bǔ)腎益沖抗衰湯組大鼠性周期規(guī)則，性周期為4～5天，每天1次陰道脫落細(xì)胞涂片觀察到動(dòng)情前期，動(dòng)情后期、間情期較模型組縮短約2～3天。

2.2 對(duì)大鼠卵巢形態(tài)學(xué)的影響 正常對(duì)照組大鼠卵巢體積大，可見(jiàn)各級(jí)卵泡，卵泡生長(zhǎng)活躍，形態(tài)規(guī)則圓潤(rùn)，顆粒細(xì)胞層次多，卵泡液含量多，卵泡飽滿；黃體發(fā)育好，體積大，黃體細(xì)胞豐富；偶見(jiàn)閉鎖卵泡。模型組大鼠卵巢體積萎縮，被皮增厚，色蒼白，各期卵泡數(shù)均明顯減少，趨于閉鎖卵泡較多，顆粒細(xì)胞層次少，黃體偏??；間質(zhì)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化。補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組大鼠卵巢顏色粉紅，血供豐富，體積、卵泡、黃體與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，可見(jiàn)各級(jí)生長(zhǎng)卵泡和較多成熟卵泡，卵泡液豐富，黃體成熟，體積較大。

2.3 對(duì)DOR大鼠血清FSH、FSH/LH、E2的影響（1）血清E2：各組大鼠血清E2較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）；補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組E2較模型組明顯增高（P＜0.05），補(bǔ)佳樂(lè)組優(yōu)于補(bǔ)腎益沖抗衰湯組（P＜0.05）。（2）血清FSH：模型組較正常對(duì)照組明顯增高（P＜0.05）；補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組FSH較模型組明顯降低（P＜0.05），補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。（3）FSH/LH：模型組較正常對(duì)照組明顯增高（P＜0.05）；補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組FSH/LH比值較模型組明顯降低（P＜0.05），補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清FSH、FSH/LH、E2變化（±s）

表1 各組大鼠血清FSH、FSH/LH、E2變化（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，#P＜0.05；E2：雌二醇；FSH：卵泡刺激素；LH：黃體生成素

組別正常對(duì)照組模型組補(bǔ)佳樂(lè)組補(bǔ)腎益沖抗衰湯組鼠數(shù)10 10 10 10 E2（pg/mL）46.08±1.69 9.81±1.18* 37.34±1.69*△21.51±1.26*△#FSH（mIU/mL）4.64±2.16 9.59±2.17* 6.89±2.86*△6.57±1.88*△FSH/LH 1.80±0.76 3.36±0.82* 2.14±0.57△2.27±0.44△

2.4 對(duì)DOR大鼠血清抗苗勒管激素（AMH）、抑制素B（INHB）的影響 與正常對(duì)照組比較，各組大鼠血清AMH均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組大鼠血清AMH水平明顯增高（P＜0.05）；與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，補(bǔ)腎益沖抗衰湯組大鼠血清AMH水平明顯增高（均P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型組INHB水平明顯降低（P＜0.05）；補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組INHB水平明顯高于模型組（P＜0.05）；補(bǔ)佳樂(lè)組、補(bǔ)腎益沖抗衰湯組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清抗苗勒管激素、抑制素B水平比較（ng/L±s）

表2 各組大鼠血清抗苗勒管激素、抑制素B水平比較（ng/L±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，#P＜0.05

3 討 論

育齡婦女長(zhǎng)期服用雷公藤（tripterygium wilfordii hook.f）可造成卵巢功能減退或衰竭[3]。有研究[4]發(fā)現(xiàn)雷公藤對(duì)動(dòng)物卵巢損害的病理結(jié)果與人類更為一致（卵巢組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)卵巢萎縮，各級(jí)卵泡減少，間質(zhì)增加，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等）。我們采用雷公藤多苷片灌胃制造卵巢儲(chǔ)備功能下降的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠毛發(fā)稀疏，無(wú)光澤，動(dòng)情周期延長(zhǎng)；卵巢萎縮，形態(tài)改變，色蒼白，卵巢內(nèi)各期卵泡數(shù)減少，閉鎖卵泡增多；黃體脂肪變性；間質(zhì)纖維化；血清FSH、FSH/ LH增高，E2降低[5-6]。模型大鼠表現(xiàn)出與人類DOR相似的一系列改變。因此可以肯定雷公藤可以制造出與人類病理結(jié)果相近的DOR模型。

AMH由竇前卵泡和小竇卵泡的顆粒細(xì)胞分泌，有抑制卵泡生長(zhǎng)，防止卵泡過(guò)快過(guò)早耗盡的作用。當(dāng)原始卵泡募集進(jìn)入初級(jí)卵泡后，卵泡進(jìn)入對(duì)FSH敏感的竇前卵泡時(shí)期，F(xiàn)SH刺激卵泡不斷生長(zhǎng)，在AMH基因缺失小鼠中發(fā)現(xiàn)，低FSH水平下AMH基因缺失小鼠比對(duì)照組有更多的生長(zhǎng)卵泡[7]，說(shuō)明AMH通過(guò)降低卵泡對(duì)FSH的敏感性而抑制FSH誘導(dǎo)的卵泡生長(zhǎng)，從而控制大量竇前或小竇卵泡繼續(xù)生長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)卵泡。近年研究者分別觀察了高度刺激和自然周期下的卵泡液，發(fā)現(xiàn)AMH是卵母細(xì)胞和卵泡發(fā)育潛能的標(biāo)記物[8]，并可作為卵巢儲(chǔ)備的定性標(biāo)記。有研究顯示隨著年齡增加，卵巢激素最早變化的是AMH，在女性出生時(shí)，外周血幾乎測(cè)不到AMH，性成熟后達(dá)最高水平，30歲后開(kāi)始下降[9]，直至絕經(jīng)期消失。La Marca等[10]研究證明，AMH在整個(gè)月經(jīng)周期的波動(dòng)極小，呈相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。這意味著臨床上可以在月經(jīng)周期的任一時(shí)期取血檢測(cè)AMH水平，從而取消對(duì)不孕患者月經(jīng)周期的限制。因此，AMH可以作為預(yù)測(cè)卵巢年齡的標(biāo)志物，更好地反映卵巢的儲(chǔ)備功能。

INHB由卵巢顆粒細(xì)胞分泌，對(duì)生殖內(nèi)分泌起調(diào)節(jié)作用，INHB可以反饋抑制垂體合成分泌FSH，并抑制促性腺激素釋放激素對(duì)自身受體的調(diào)節(jié)作用，還可以通過(guò)自分泌/旁分泌調(diào)節(jié)E2的產(chǎn)生[11]。通過(guò)對(duì)DOR患者的基因測(cè)序也發(fā)現(xiàn)，INHB基因的多態(tài)性與DOR的發(fā)生密切相關(guān)并且血清INHB水平下降是較E2水平下降的一個(gè)更早期的事件。因此INHB 和FSH、E2一樣可以反映卵巢的功能狀態(tài)并可能成為反映卵巢功能衰退的更敏感的指標(biāo)。

中醫(yī)認(rèn)為，腎虛是卵巢功能減退的主要病因病機(jī)，血虛、血瘀為該病的主要環(huán)節(jié)，此外亦包括情志因素、生活因素和體質(zhì)因素等[12]。腎為先天之本，主藏精氣，腎中精氣（陰、陽(yáng)）的盛衰，主宰著人體的生長(zhǎng)發(fā)育及生殖功能的成熟和衰退，故腎中精氣充盛，天癸成熟，月經(jīng)來(lái)潮而有子，標(biāo)志著女性卵巢生殖周期活動(dòng)的開(kāi)始；腎中精氣衰退，天癸耗竭，月經(jīng)閉絕，提示女性卵巢生殖功能的結(jié)束。張吟等[13]也認(rèn)為DOR病機(jī)以腎氣不足，腎精虧虛為基礎(chǔ)。肝氣郁結(jié)，血行不暢,或氣血不足，沖任不充，血?？仗?，胞宮失養(yǎng)，是該病發(fā)生的重要條件。

補(bǔ)腎益沖抗衰湯臨床主要用于腎虛、氣血不足、沖任失養(yǎng)之月經(jīng)稀少、閉經(jīng)、不孕者，即因DOR引起的月經(jīng)失調(diào)等內(nèi)分泌紊亂疾病，有補(bǔ)腎陰腎陽(yáng)，調(diào)沖任，養(yǎng)血化瘀之功效，方中巴戟天、菟絲子、淫羊藿、鹿角片溫補(bǔ)腎陽(yáng)是為君藥；臣知母、黃柏滋腎陰、瀉腎火；佐熟地、枸杞子補(bǔ)腎養(yǎng)陰；龜板、鹿角片等血肉有情之品，陰陽(yáng)共補(bǔ)，意在陰中求陽(yáng)，陽(yáng)中求陰，補(bǔ)腎調(diào)沖抑亢；更用靈芝補(bǔ)氣血，抗衰老，山藥、太子參健脾（胃）補(bǔ)腎，意在養(yǎng)心益腎補(bǔ)后天而益先天；當(dāng)歸、丹參、牛膝、茺蔚子活血和血調(diào)經(jīng)。以上各藥合用，使腎氣腎精充盈，沖任氣血調(diào)和，臟腑平衡則月經(jīng)如期而至，精卵結(jié)合，孕育成胎。有學(xué)者對(duì)單味中藥進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)菟絲子、枸杞子等具有雌激素樣活性[14-15]，能促進(jìn)下丘腦—垂體促性腺功能，提高垂體對(duì)促性腺激素釋放激素的反應(yīng)性，增強(qiáng)卵巢功能，改善神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，具有誘發(fā)排卵作用。藉此推測(cè)補(bǔ)腎益沖抗衰湯不僅在宏觀整體上進(jìn)行辨證調(diào)節(jié)，也使微觀局部功能得以改善。進(jìn)而闡釋了本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠服用補(bǔ)腎益沖抗衰湯后卵巢組織中卵泡數(shù)目增多、血AMH、INHB水平升高、FSH、LH、E2得到改善的原因。卵泡數(shù)目增多，竇卵泡和竇前卵泡分泌AMH增多，降低了卵泡對(duì)FSH的敏感性，減少卵泡的過(guò)早耗盡；成熟卵泡增多，顆粒細(xì)胞分泌INHB增多，INHB反饋抑制垂體合成分泌FSH，增加E2合成，抑制促性腺激素釋放激素對(duì)自身受體的調(diào)節(jié)作用，保護(hù)卵巢功能，提高卵巢的儲(chǔ)備功能。本研究結(jié)果為臨床治療卵巢儲(chǔ)備功能下降提供了理論依據(jù)和新思路。

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（收稿：2015-10-08 修回：2016-01-11）

Influence of Bushen Yichong Kangshuai Decoction on AMH and INHB of Rats with Diminished OvarianReverse

ZHU Chengfen1,QIU Xiaoxiao1,SHUAI Jun2,CHENG Jing1,CHENG Lei1,ZHU Changling2. 1 Department of Infertility,Wenzhou Zhongshan Hospital,Wenzhou 325000,China;2 Department of Gynecology&Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Ningbo University,Ningbo 315000,China

ObjectiveTo observe the influence of Bushen Yichong Kangshuai Decoction（BSYCKSD）on endocrine and anti-Mullerian（AMH）and inhibin B（INHB）expressions of diminished ovarian reserve model rats.MethodsEight-week old 40 healthy female rats as the research object were divided into normal control group, model group,prognova group,BSYCKSD group,with 10 rats in each group.Except for normal control group,tripterygium wilfordii and corresponding medicinewere used to set up diminished ovarian reserve model in rats.The estrous cycle was determined through the observation of vaginal smear.The morphological changes of ovarian tissue was observed by light microscopic.ELISA method was for measuring serum estradiol（E2）,follicle stimulating hormone （FSH）,luteinizing hormone（LH）,AMH and INHB.ResultsIn BSYCKSD group,the estrous cycle of rats lasted 4 to 5d,the development of mature follicles was promoted,and the endocrine levelswas improved compared with model group（E2：21.51±1.26pg/mL vs 9.81±1.18pg/mL;FSH：6.57±1.88mIU/mL vs 9.59±2.17mIU/mL;FSH/LH：2.27±0.44 vs 3.36±0.82;all P＜0.05）and the levels of AMH（114.45±11.11 ng/L vs 100.27±9.17ng/L，P＜0.05）and INHB（56.91±1.74ng/L vs 26.28±6.19ng/L，P＜0.05）were increased.ConclusionBSYCKSD can improve sex hormone levels in rats with diminished ovarian reserve,increase the level of AMH and INHB,and reduce the follicular atresia,resulting in enhancing the reserve function of ovary.

rats;diminished ovarian reserve;Bushen Yichong Kangshuai Decoction;anti-Mullerian;inhibin B

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011ZB143）；浙江省溫州市醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究項(xiàng)目（No.2011B053）；浙江省溫州市鹿城區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.Y12003）

1浙江省溫州中山醫(yī)院不孕不育科（溫州325000）；2寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（寧波 315000）

朱長(zhǎng)玲，Tel：18858033268；E-mail：1208302530@qq.com