宮曉靜，萬玲琴，王義善

基礎(chǔ)醫(yī)學

黑蒜提取液對胰腺癌Panc－1細胞生長與抗氧化分子機制的實驗研究＊

宮曉靜，萬玲琴，王義善＊

目的 探討黑蒜提取液（aged black garlic extract，ABGE）對Panc－1細胞生長與抗氧化能力的影響。方法 將不同濃度的ABGE（0．2、1．0、1．8 mg／ml）作用于Panc－1細胞，采用CCK－8法分別于24 h、48 h、72 h測定Panc－1細胞株的生長能力；RT－PCR檢測ABGE干預(yù)后Panc－1細胞VEGFmRNA以及MMP－9mRNA表達變化；ELISA法檢測Panc－1細胞上清液中相關(guān)蛋白VEGF、SOD的表達情況。結(jié)果CCK－8結(jié)果顯示，黑蒜提取液對Panc－1細胞株的生長活性具有明顯的抑制作用，且具有時間劑量依賴關(guān)系；RT－PCR結(jié)果顯示，黑蒜提取液能明顯地上調(diào)VEGFmRNA以及下調(diào)MMP－9mRNA的表達；ELISA法結(jié)果顯示，隨黑蒜提取液濃度的增加，Panc－1細胞上清液中VEGF蛋白的表達水平下降、SOD蛋白表達增加。結(jié)論 黑蒜提取液能顯著抑制Panc－1細胞的生長能力，其抗氧化能力可能是與下調(diào)VEGF蛋白表達、MMP－9以及上調(diào)SOD表達有關(guān)。

黑蒜提取液；Panc－1細胞；VEGF蛋白；SOD蛋白；細胞生長；抗氧化能力

胰腺癌是一種最為常見消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率約占所有腫瘤的5%，近幾年以來并有發(fā)病率持續(xù)上升的趨勢，胰腺癌具有惡性程度極高，發(fā)展快，早期轉(zhuǎn)移，治療效果較差，并且死亡率較高的特點，因此能在早期診斷對于治療胰腺癌有至關(guān)重要的作用［1］。隨著分子生物學、細胞生物學的發(fā)展以及人們對胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制認識的加深，目前胰腺癌的研究逐步深入到分子機制水平［2］。本研究主要從細胞分子水平；來研究胰腺癌在生長增殖階段的發(fā)生機制。而隨著中國醫(yī)學的發(fā)展，中醫(yī)藥對于腫瘤發(fā)生進展中作用日益發(fā)揮重要作用，諸多被研究證實具有較好的抗腫瘤，提高機體免疫力的作用，具有良好的發(fā)展前景。

黑蒜是將新鮮的大蒜在一定的溫度濕度條件下經(jīng)過一系列的加工工藝，并且保留了大蒜原有的活性有效成分，最大限度地發(fā)揮了其抗腫瘤的作用機制，且能較穩(wěn)定地保存。黑蒜中含有三十多種化合物，其中主要有效成分為大蒜素?，F(xiàn)代實驗研究已經(jīng)證實，黑蒜具有明顯的抗腫瘤、抗氧化的作用［3］。本實驗黑蒜提取液由中國人民解放軍第107醫(yī)院中心實驗室提供，前期諸多實驗已經(jīng)證明黑蒜提取液能夠?qū)θ宋赴㏒GC－7901、小鼠肝癌Hep－A22有抑制腫瘤生長和抗氧化的作用［4］。但是對胰腺癌的作用研究較少，本實驗研究黑蒜提取液對胰腺癌Panc－1細胞生長增殖以及氧化作用的影響以及作用的分子機制，為后期的黑蒜運用于臨床提供更多的理論實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器黑蒜購于大連華谷蒜業(yè)有限公司，剝外皮后將100 g果脯膏狀黑蒜搗碎制成醬狀，充分浸泡在95%1000 ml乙醇中24 h，后真空過濾重復(fù)多次，將濾液放于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上中，使其最終溫度不超過47．5℃，最終將其濃縮到50 ml，用0．9% 50 ml生理鹽水將其充分溶解，一般用0．22 μm濾膜過濾制成黑蒜提取液。相當于生藥1 g／ml，放于4℃保存以備后續(xù)實驗。DMEM高糖培養(yǎng)基、已滅活胎牛血清：美國Hyclone公司；胰蛋白酶：Amersco公司；DMSO：安徽安特化工有限公司；CCK－8試劑：碧云天生物公司；RNAiso Plus：大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：大連TaKaRa公司；Realtime－PCR試劑盒：大連TaKaRa公司；小鼠抗人VEGF ELISA試劑盒、抗氧化SOD檢測試劑盒購自碧云天生物公司。

1．2 細胞以及細胞處理人胰腺癌Panc－1細胞株購自中科院上海細胞庫，將胰腺癌Panc－1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 mg／L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)無菌培養(yǎng)，保持細胞單層貼壁生長，生長至80%～90%融合時將細胞用0．25%的胰蛋白酶消化后傳代，取對數(shù)生長期的細胞做后續(xù)實驗。

1．3 CCK－8法檢測Panc－1細胞體外生長增殖活性選取對數(shù)生長期Panc－1細胞，輕輕反復(fù)吹打細胞懸液使之均勻后，以DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至5×104／ml，輕輕反復(fù)吹打細胞懸液使之均勻后，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液100 μl，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組（0．1% DMSO），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，加入含有不同濃度的黑蒜提取液的DMEM培養(yǎng)基，使其終濃度分別為0．2、1．0、1．8 mg／ml，后繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后取出培養(yǎng)板，每孔再加入10 μl CCK－8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標儀在450 nm處測定每個孔的吸光度值（A值），計算細胞的生長抑制率。細胞生長抑制率＝（1－實驗組A值／對照組A值）×100%。用SPSS13．0統(tǒng)計軟件分析處理。

1．4 RT－PCR檢測黑蒜提取液VEGFmRNA以及MMP－9mRNA的表達活性細胞以1．0×105個／ml的密度接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，于37℃培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁之后，選取0．2，1．0，1．8 mg／ml的黑蒜提取液濃度作用于細胞，24 h后收集對數(shù)生長期細胞，并設(shè)最終濃度0．1%PBS濃度為對照組，RNAiso Plus提取總RNA，核酸分析儀檢測RNA純度，OD260／OD280在1．9～2．1之間，純度較好，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行PCR反應(yīng)。引物有青島生物工程有限公司合成VEGFmRNA上游引物序列為：5'－GACTTGTGTTGGGAGGAGGA－3'，下游引物序列為 5'－TCTGGAAGTGAGCCAATG TG－3'；MMP－9mRNA上游引物序列為：5'－CTGGCG TGTGAGTTTCCAA－3'，下游引物序列為5'－CGGTT GAAGCAAAGAAGGAG－3'。反應(yīng)體系的配制：SYBR Premix Ex Tap（2×）10 μl、PCR Reverse Primer（10 μmol／L）0．8 μL、DNA模板2．0 μl以及dH2O 7．2 μl共20 μl液體混勻，置于Real time－PCR擴增儀中，按照Real time－PCR反應(yīng)程序：95℃30 s；PCR反應(yīng)95℃ 5 s，60℃ 20 s，40 cycles；溶解曲線分析基因改變。

1．5 ELISA檢測Panc－1細胞上清液VEGF、SOD含量細胞以1．0×105個／ml的密度接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，于37℃培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁之后，選取0．2、1．0、1．8 mg／ml的黑蒜提取液濃度作用于細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，孵育48 h后收集細胞上清液，依照ELISA試劑盒操作流程測定VEGF以及SOD蛋白的濃度。

1．6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13．0軟件分析數(shù)據(jù)，各實驗重復(fù)3次，兩樣本比較采用t檢驗，樣本均數(shù)比較采用均數(shù)±標準差（±s）表示。以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 CCK－8實驗檢測結(jié)果CCK－8實驗檢測結(jié)果顯示黑蒜提取液對Panc－1細胞的生長增殖具有明顯的抑制作用，并且隨著黑蒜提取液濃度和反應(yīng)時間的增加，Panc－1細胞生長力明顯下降。選用不同濃度的黑蒜提取液（0．2，，1．0，1．8mg／ml）對Panc－1細胞24 h的生長抑制率（%）分別為9．53±1．31、25．7±3．02、42．45±2．88；48 h的細胞生長抑制率（%）分別為14．5±3．64、28．45±3．57、50．27±3．26；72 h的細胞生長抑制率（%）分別為16．79±3．26、30．58±3．27、55．64±5．42。明顯看出隨著黑蒜提取液濃度和反應(yīng)時間的增加，Panc－1細胞的生長能力明顯下降，與空白對照組具有顯著性差異（P＜0．05）。見圖1。

圖1 黑蒜提取液不同濃度對Panc-1細胞生長抑制率的比較

2．2 RT－PCR檢測結(jié)果經(jīng)PCR實驗檢測后得到空白對照組及各黑蒜提取液實驗組VEGFmRNA以及MMP－9mRNA表達結(jié)果顯示，與空白對照組比較，經(jīng)不同濃度黑蒜提取液24 h處理后的Panc－1細胞中VEGFmRNA以及MMP－9mRNA的含量均明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表1，圖2a、b。

表1 黑蒜提取液對Panc－1細胞相關(guān)基因mRNA表達的影響（±s，n＝3）

表1 黑蒜提取液對Panc－1細胞相關(guān)基因mRNA表達的影響（±s，n＝3）

注：與空白對照組比較，＊P＜0．05。

mRNA含量 空白對照組 黑蒜提取液0．2mg／ml組黑蒜提取液1．0mg／ml組黑蒜提取液1．8mg／ml組VEGF mRNA 1．09±0．10 0．77±0．02＊ 0．62±0．01＊ 0．45±0．01＊MMP－9mRNA 4．12±0．24 3．21±0．35＊ 2．11±0．04＊ 1．17±0．02＊

圖2a 黑蒜提取液對Panc－1細胞VEGFmRNA表達的影響

圖2b 黑蒜提取液對Panc－1細胞MMP－9mRNA表達的影響

2.3 ELISA法檢測結(jié)果ELISA試劑盒檢測結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度（0、0．2、1．0、1．8 mg／ml）黑蒜提取液作用于Panc－1細胞48 h之后，分別收集各組細胞上清液檢測，各組上清液VEGF含量分別為0．98± 0．02 ng／ml、0．70±0．06 ng／ml、0．51±0．02 ng／ml、0．40± 0．04 ng／ml；各組上清液SOD蛋白含量分別為0．23± 0．03 ng／ml、0．45±0．02 ng／ml、0．62±0．01 ng／ml、0．78± 0．02 ng／ml。隨著黑蒜提取液濃度的增加，VEGF含量呈下降趨勢；SOD含量呈上升趨勢，與空白對照組比較具有顯著性差異（P＜0．05）。見圖3、4。

圖3 黑蒜提取液對Panc－1細胞上清液VEGF蛋白表達影響

圖4 黑蒜提取液對Panc－1細胞上清液SOD蛋白表達影響

3 討 論

黑蒜是指大蒜經(jīng)過特殊加工工藝而制成的新型食藥同用的中藥材，其中大蒜素是主要活性成分，其中主要成分是二烯丙基三硫化物DATS，具有明顯的殺菌消炎、抑制腫瘤細胞生長以及抗氧化的作用。本實驗以黑蒜為研究，研究了黑蒜提取液作用于胰腺癌Panc－1細胞后細胞的生長活性以及抗氧化的機制。

腫瘤細胞生長與轉(zhuǎn)移的一個主要條件是新生血管的生成。VEGF就是其中重要的促腫瘤血管生成因子，與腫瘤細胞的生長形成以及后期的轉(zhuǎn)移惡化又有重要的聯(lián)系［5］。前人已有研究證實［6］，黑蒜提取液中的有效成分大蒜素可以有效地抑制結(jié)腸癌HT29細胞的生長增殖。如果能做到有效地下調(diào)VEGF的含量表達，就可以有效地達到降低新生血管的形成，從而抑制腫瘤細胞的形成與生長［7］。而SOD（氧化物歧化酶）能夠直接反映機體消除超氧基的能力，到達維持機體自由基產(chǎn)生與消除的平衡狀態(tài)。VEGF表達的高低還對細胞基質(zhì)的降解有重要的作用，研究證實能夠有效下調(diào)VEGF，可以明顯降低細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶的含量［8］，本實驗中以MMP－9為實驗研究對象。當SOD含量下降時，機體的清除氧自由基的能力就會下降，造成氧離子蓄積，過多會相應(yīng)地對細胞造成損傷，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生［9］。因此若能有效地調(diào)節(jié)VEGF以及SOD含量，將對腫瘤細胞的生長增殖產(chǎn)生關(guān)鍵作用。本實驗研究中，黑蒜提取液能夠顯著地降低Panc－1細胞的生長增殖，并且具有時間及濃度依賴性關(guān)系；經(jīng)不同濃度的黑蒜提取液處理的Panc－1細胞的VEGF以及SOD含量均有不同程度的下降和上升趨勢。

經(jīng)上所述，黑蒜提取液可以通過下調(diào)VEGF蛋白含量，以及下調(diào)MMP－9含量，上調(diào)SOD含量有效地抑制胰腺癌Panc－1細胞的生長能力，提高細胞的抗氧化能力。然而，其中的具體分子機制仍待解決研究。

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［2015-10-19收稿，2015-11-17修回］

［本文編輯：韓仲琪］

Molecular mechanism ofaged black garlic extracton pancreatic cancer－1 cellgrowth and antioxidant ability：Experimental study

GONG Xiao－jing①，WAN Ling－qin，WANG Yi－shan.①
Binzhou Medical University，Yantai，Shandong 264003，China

ObjectiveTo explore molecular mechanism of aged black garlic extract（ABGE）on pancreatic cancer－1 cell growth and antioxidant ability．MethodsThe different concentrations of ABGE（0．2，1．0，1．8 mg／ml）acted as Panc－1 cell，the growth activity of Panc－1 was detected by CCK－8 at 24，48 and 72 h；the VEGF and SOD in supernatant of Panc－1 was detected by ELISA method；and the VEGFmRNA and MMP－9mRNA protein expression of Panc－1 was detected by Real-time－PCR．ResultsCCK－8 test showed that ABGE had the inhibitory effect on Panc－1 and in a time－dose－dependent manner；ELISA method showed that down－regulating VEGF and up－regulating SOD protein expression；Real-time－PCR test showed that ABGE could obviously downregulate VEGF and MMP－9 protein expression.Conclusion Aged black garlic extract can significantly inhibit pancreatic cancer－1 cell growth and tranfer，which may be the cause ABGE could interfere TGF－β1／Smad4 signaling pathway．

Aged black garlic extract；Pancreaticcancer－1；VEGF；SOD protein；Cell growth；Antioxidant ability

R735.9

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.04.018

全軍科技攻關(guān)項目（06G034）

264003山東煙臺，濱州醫(yī)學院（宮曉靜，萬玲琴，王義善）；264002山東煙臺，解放軍107醫(yī)院全軍腫瘤重點治療及無創(chuàng)診療中心（王義善）

王義善，Email：wangyishan288＠163．com