姜華年

(麗水學院 生態(tài)學院，浙江 麗水 323000)

?

厚樸內(nèi)生真菌HPFJ3菌絲體中抑菌活性物質(zhì)的分離純化及結構鑒定

姜華年

(麗水學院 生態(tài)學院，浙江 麗水 323000)

為了促進厚樸內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用，以一株對小麥全蝕病菌具有較高抑菌活性的厚樸內(nèi)生真菌黑孢霉HPFJ3菌株(Nigrosporasp.HPFJ3)為研究材料，對發(fā)酵菌絲體甲醇粗提物中能夠抑制植物病原菌生長的活性物質(zhì)進行分析。通過活性指導下的色譜分離，從甲醇提取物中得到3種化合物，質(zhì)譜(MS)和核磁共振波譜(NMR)鑒定結果表明，3種化合物分別為麥角甾醇、對羥基苯甲酸以及4-羥基-18碳酸?；钚詸z測試驗顯示，麥角甾醇和對羥基苯甲酸2種化合物對小麥全蝕病菌均具有生長抑制作用，且麥角甾醇的抑菌活性較強，抑菌率達到66.70%；而4-羥基-18碳酸對小麥全蝕病菌無生長抑制作用。

內(nèi)生真菌； 黑孢霉； 小麥全蝕病菌； 化學成分； 結構鑒定； 抑菌活性

由禾頂囊殼小麥變種(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)侵染小麥引起的全蝕病(wheat take-all)是一種重要的小麥根部病害[1]，主要危害小麥的根部和莖基部，在我國主要小麥產(chǎn)區(qū)均有廣泛發(fā)生，嚴重制約小麥產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的提高。目前,主要是利用化學藥劑防治該病,然而化學農(nóng)藥在使用過程中容易引起環(huán)境污染、藥害、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標、農(nóng)田生態(tài)平衡和生物多樣性被破壞等問題[2]。因此生物防治逐步發(fā)展成為小麥全蝕病的重要綠色防控技術。

植物內(nèi)生菌(endophytic fungus) 是指在其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物的各組織和器官內(nèi)部，并不引起植物組織產(chǎn)生明顯病害癥狀的微生物[3]。內(nèi)生菌能夠與寄主植物協(xié)同進化，形成互惠共生的關系，研究表明,植物內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物不但可以促進寄主植物的生長發(fā)育，且能夠提高植物抗逆、抗病等方面的能力[4-7]，是篩選開發(fā)新型微生物源農(nóng)藥或增產(chǎn)菌劑的重要資源。目前，關于植物內(nèi)生菌的研究主要集中在藥用植物[8]、農(nóng)作物[9]以及特殊生境植物[10]等，其中從藥用植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物中尋找新型活性物質(zhì)，仍是當前內(nèi)生菌研究的主流之一[8,11-12]。厚樸(Magnoliaofficinalis)屬于木蘭科木蘭屬喬木，為我國特有的經(jīng)濟樹種。相關研究表明，厚樸的化學成分主要為厚樸酚、槲皮苷、生物堿等，這些化學成分在醫(yī)學上具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等作用，因此，厚樸擁有較大的應用價值和開發(fā)價值[13-14]。麗水學院生態(tài)學院植物學課題組前期自厚樸健康莖組織中分離到一株內(nèi)生真菌HPFJ3，其在離體條件下對小麥全蝕病菌具有較高抑菌活性，本試驗通過抑菌活性指導下的色譜分離技術，對該菌株發(fā)酵菌絲體的甲醇粗提物進行分離、純化、鑒定，以期發(fā)現(xiàn)具有抑制植物病原菌活性的化合物，為后續(xù)進行微生物源農(nóng)藥的開發(fā)奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 生防菌HPFJ3為麗水學院生態(tài)學院植物學課題組分離自厚樸健康莖組織中的一株內(nèi)生真菌，在離體條件下對小麥全蝕病菌具有較高抑菌活性，經(jīng)鑒定其屬于黑孢霉屬(Nigrospora)真菌(NCBI登錄號：KP795394)。

抑菌活性測試菌株為小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)，由麗水學院生態(tài)學院植物學課題組保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL，pH值自然。121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL、pH值自然。121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器和試劑 主要儀器：SENCO R-502B型旋轉蒸發(fā)器由上海申勝生物技術公司生產(chǎn)；SIGMA3K30 高速臺式冷凍離心機由北京博勵行儀器有限公司生產(chǎn)；高效液相色譜儀(SP930D高壓泵、UV730D檢測器、Autochro2000色譜工作站、SDV30混合器)由韓國YOUNGLIN公司生產(chǎn)；分析柱ODS2C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、制備柱ODS2C18(20 mm×250 mm，5 μm)均為美國Waters公司生產(chǎn)；HPLC-MS、ESI 離子源(6210 Time of Flight LC/MS)均為美國Agilent公司生產(chǎn)；核磁共振儀(400 MHz)由美國BRUKER公司生產(chǎn)。

主要試劑：柱層析硅膠(70～150 μm)由中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司生產(chǎn)；GF254高效薄層硅膠板由青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)；色譜純甲醇、色譜純乙腈由江蘇恒安試劑公司生產(chǎn)；分析純乙酸乙酯、分析純甲醇及分析純石油醚均為上海一試化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 厚樸內(nèi)生真菌HPFJ3的發(fā)酵及甲醇粗提物制備 種子液制備：將HPFJ3菌株接種至裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，在(26±2)℃、150 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)4～5 d，獲得種子液；發(fā)酵產(chǎn)物制備：相同條件下，將種子液分別轉接到裝有300 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的1 000 mL 錐形瓶中，搖床培養(yǎng)7 d，共獲得發(fā)酵產(chǎn)物30 L。

菌株HPFJ3的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)離心機離心、過濾，分別得到發(fā)酵液和菌絲體。將菌絲體冷凍干燥至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，在固液比1∶5、40～50 ℃ 的條件下，依次用分析純甲醇浸提3次，每次8～10 h，浸提液于50 ℃真空濃縮蒸干，得浸膏6.48 g，即為HPFJ3 菌絲體的甲醇粗提物。

1.2.2 厚樸內(nèi)生真菌HPFJ3甲醇粗提物的分離與純化 將HPFJ3 菌絲體的甲醇提取物(6.48 g)用適量甲醇溶解后，用薄層層析硅膠H60(15 g)拌樣，石油醚飽和薄層層析硅膠H60裝柱(層析柱直徑4.5 cm、高100 cm)，利用柱層析技術對甲醇提取物進行初步分離純化，分離過程中利用石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫，自動收集，逐管點樣進行薄層分析(展開劑為乙酸乙酯∶甲醇=10∶1，顯色劑為硫酸-水溶液和碘化鉍鉀試劑)[15]，最終得到10個組分。

1.2.3 10個組分的抑菌活性檢測 將10個不同組分低溫濃縮稱質(zhì)量，分別取樣品若干，用無菌水配制成 2 mg/mL的母液。吸取10個不同組分的母液各500 μL于無菌培養(yǎng)皿(直徑9 cm)內(nèi)，與10 mL PDA培養(yǎng)基迅速混勻,制成混合平板，以加入無菌水為空白對照。采用菌絲生長速率法[16-18]對10個不同組分進行抑菌活性檢測，處理組和空白對照組各設3個重復，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待空白對照滿皿后，用十字交叉法測量處理組菌落直徑。處理組對小麥全蝕病菌菌絲生長的抑制率按如下公式計算：菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

1.2.4 活性組分抑菌物質(zhì)的分離純化和結構鑒定

1.2.4.1 活性組分5中抑菌物質(zhì)分離純化 將活性組分5配制成約1 mg/mL的樣品溶液，進行高效液相色譜(HPLC)分析，以甲醇0～100%、水100%～0的梯度進行梯度洗脫，洗脫速度為1 mL/min，洗脫時間30 min。二極管陣列檢測器(DAD)檢測波長為200～400 nm。

根據(jù)活性組分5的HPLC分析結果，將活性組分5溶于甲醇中，配成50 mg/mL的質(zhì)量濃度，進樣0.8 mL，進行樣品制備。制備柱為Waters ODS2反相C18，規(guī)格為20 mm×250 mm，粒徑5 μm；流動相：0～5 min 100%水，5～15 min 20%甲醇，15～25 min 40%甲醇，25～40 min 60%甲醇，40～60 min 80%甲醇，60～80 min 100%甲醇。洗脫速度15 mL/min，檢測波長210 nm。80%甲醇梯度洗脫得化合物1 。

1.2.4.2 活性組分8中抑菌物質(zhì)分離純化 將活性組分8配制成約1 mg/mL的樣品溶液，進行HPLC分析，以甲醇0～100%、水100%～0的梯度進行梯度洗脫，洗脫速度為1 mL/min，洗脫時間40 min。DAD檢測波長為200～400 nm。

根據(jù)活性組分8的HPLC分析結果，將活性組分8溶于甲醇中，配成125 mg/mL的質(zhì)量濃度，進樣0.6 mL，進行樣品制備。制備柱為Waters ODS2反相C18，規(guī)格為20 mm×250 mm，粒徑5 μm；流動相：0～10 min 100%水，10～20 min 20%甲醇，20～25 min 40%甲醇，25～40 min 60%甲醇，40～60 min 100%甲醇。洗脫速度15 mL/min，檢測波長260 nm。分別于20%甲醇和100%甲醇梯度下洗脫得化合物2和化合物3 。

1.2.4.3 化合物的結構鑒定 借助液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)、核磁共振波譜分析(1H-NMR、13C-NMR)等技術對獲得的化合物進行結構鑒定。

1.2.5 3種化合物的抑菌活性檢測

采用菌絲生長速率法檢測3種化合物對小麥全蝕病菌生長的抑制作用。3種化合物分別用無菌水配制成 0.5 mg/mL的母液，接下來的操作同1.2.3。設置無菌水為空白對照，75%多菌靈可濕性粉劑(購自江蘇省江陰農(nóng)藥廠)稀釋800倍液為陽性對照。25 ℃恒溫培養(yǎng)，待空白對照長滿皿后，用十字交叉法測量處理組菌落直徑，計算3種化合物對小麥全蝕病菌菌絲生長的抑制率。

2 結果與分析

2.1 厚樸內(nèi)生真菌HPFJ3甲醇粗提物的分離純化結果

本研究利用常壓硅膠柱色譜、高效液相色譜等技術對厚樸內(nèi)生真菌HPFJ3甲醇粗提物以及活性化合物進行分離、純化和制備。

2.1.1 活性組分的初步分離 對厚樸內(nèi)生真菌HPFJ3甲醇粗提物過柱后的10個組分進行抑菌活性測定，發(fā)現(xiàn)小麥全蝕病菌可在含組分1、組分2以及組分10的培養(yǎng)基上生長，說明這3個組分對小麥全蝕病菌的生長無抑制作用；其余7個組分中，組分5和組分8有較好的抑菌活性，其在0.1 mg/mL的質(zhì)量濃度下對小麥全蝕病菌的生長抑制率分別達到44.62%、33.52%(表1)。在后續(xù)試驗中，對上述2個組分進行分離純化，以期得到具有抑菌活性的化合物單體。

表1 甲醇粗提物過柱后的10個組分對小麥全蝕病菌的抑菌活性

2.1.2 活性組分的分離純化 利用甲醇-水梯度洗脫法對活性組分5和組分8 分別進行分離純化，共得到3種化合物，色譜分析發(fā)現(xiàn)此3種化合物在洗脫過程中均僅有1個主峰出現(xiàn)，試管收集主峰，進一步的高效薄層色譜分析(HPTLC)和HPLC分析均表明主峰為純化合物，制備收集化合物，經(jīng)脫溶、真空冷凍干燥最終得到化合物1(12.6 mg)、化合物2(6.3 mg)和化合物3(11.4 mg)。

2.2 3種化合物的結構鑒定結果

2.2.1 化合物1

2.2.1.1 質(zhì)譜分析 取純化后的凍干粉配制成0.1 mg/mL的甲醇溶液進行HPLC-MS分析。結果顯示，陽離子模式M/Z：397.297 5(M+H)+峰(圖1)。由于化合物1的分子量和氫分子量的和為397，可知化合物1的分子量為396，可能分子式為C28H44O。

圖1 化合物1的質(zhì)譜分析(+Q)

利用Chapman & Hall天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫檢索分子量為396的相關化合物，發(fā)現(xiàn)麥角甾醇(9-glucopyranosyl theophylline)的分子量為396；此外，麥角甾醇為白色粉末狀化合物，與本研究得到的化合物1物理性狀一致。因此，初步推斷化合物1可能為麥角甾醇。

2.2.1.2 核磁共振波譜分析(NMR) 為進一步證實前面的推斷，本研究繼續(xù)用NMR進行分析。1H圖譜(圖2)顯示該化合物具有典型的甾醇類化合物特征，經(jīng)與標準譜對照，發(fā)現(xiàn)該圖譜與麥角甾醇的圖譜一致，在此基礎上又進行了碳譜(圖3)及DEPT 135圖譜(圖4)分析。13C譜給出了28個碳的信號，而DEPT 135 圖譜表明該化合物有多個CH2和處于環(huán)交接處的CH峰，因此，結合13C譜與DEPT 135 圖譜分析可知，該化合物有5個季碳、6個甲基、7個亞甲基、10個次甲基，其中6個不飽和碳分別為甾醇的5、6、7、8、22、23位的碳原子，位移值為70.35的是接羥基的碳原子，這些與麥角甾醇完全一致。結合質(zhì)譜、氫譜以及碳譜，可知此化合物為麥角甾醇(圖5)。

圖2 化合物1的核磁共振氫譜

圖3 化合物1的核磁共振碳譜

圖4 化合物1的DEPT 135 圖譜

圖5 麥角甾醇結構

2.2.2 化合物2

2.2.2.1 質(zhì)譜分析 質(zhì)譜分析表明，該化合物陰離子流信號較強，而陽離子流信號相對較弱，說明該化合物可能是一種偏酸性的化合物。陰離子模式M/Z：137.0254(M-H)峰、93.0362(M-COOH)峰(圖6)；陽離子模式M/Z：139.0507(M+H) 峰(圖7)。由此可知，化合物2的分子量為138，含有1個羧基，可能分子式為C7H6O3。

圖6 化合物2的質(zhì)譜分析(-Q)

圖7 化合物2的質(zhì)譜分析(+Q)

利用Chapman & Hall天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫檢索分子量為138的相關化合物，發(fā)現(xiàn)目前報道的對羥基苯甲酸的分子量恰好是138，因此，可初步推斷化合物2為對羥基苯甲酸。

2.2.2.21H核磁共振圖譜分析 該化合物在位移值為6.8和7.8處有2個相互偶合的峰，偶合常數(shù)為8.2左右，可能是苯環(huán)對位取代后2組相互偶合的氫，也可能是苯環(huán)上2個偶位偶合的氫(圖8)。結合質(zhì)譜分析結果(該化合物含有1個羧基)，可知該化合物為對羥基苯甲酸，結構式見圖9。

圖8 化合物2的核磁共振氫譜

圖9 對羥基苯甲酸結構

2.2.3 化合物3

2.2.3.1 質(zhì)譜分析 化合物3的陽離子圖譜如圖10，結合其碳譜(圖11)及氫譜(圖12)，可分析推斷M/Z=323.2為化合物3的M+Na+峰，而相對于323.2的其他峰M/Z=274.4、M/Z=246.3等均為雜質(zhì)峰，化合物3的分子量為300.0，分子式可能為C18H36O3，且不飽和度=1。

圖10 化合物3的質(zhì)譜分析(+Q)

圖11 化合物3的核磁共振碳譜

圖12 化合物3的核磁共振氫譜

2.2.3.2 NMR分析 化合物3的碳譜(圖11)顯示，在δ=179.377 ppm處有1個羧基碳，說明此化合物為羧酸類物質(zhì)，其含有的3個氧中有2個屬于羧酸，而δ=72.093 ppm處有一連雜原子的碳，因此可推斷出δ=72.093 ppm處的碳必然連有羥基。在此化合物的13C圖譜上可明顯看到，δ=14.092 ppm處有一甲基碳，δ22～δ37之間恰好是16個脂肪碳。此外，由碳譜上可觀察到有3個碳信號峰(δ31～δ37)偏向低場，它們可能是靠近羧基和羥基，而另外3個偏向較高場的碳信號峰(δ14～δ24)應是末端甲基和亞甲基，中間信號較相近的則是脂肪烴的中間重復的亞甲基。推斷該化合物可能是4-羥基-18碳酸。

在該化合物的氫譜(圖12)上可看到典型的脂肪烴的特征，從氫的總數(shù)上來看，氫的總數(shù)為30，少于分子式中的36，此結果可能與測試儀器存在的誤差有關。從δ=3.5 ppm的大致位移來看，可能是羥基氫的位移值，此分析結果與碳譜推斷的結果一致。而且圖中δ=2.3 ppm處的3重峰是臨近羰基碳的氫，而δ=1.6 ppm處的則為臨近連羥基碳的氫，此推論與前面估計羥基在4位的推斷一致。通過對化合物3的核磁共振分析，可知此化合物為4-羥基-18碳酸，結構式見圖13。

圖13 4-羥基-18碳酸結構

2.3 3種化合物的抑菌活性

從表2可看出，化合物4-羥基-18碳酸對小麥全蝕病菌的生長無抑制作用，全蝕病菌可以在含有4-羥基-18碳酸的培養(yǎng)基上生長；麥角甾醇和對羥基苯甲酸均對小麥全蝕病菌的生長有抑制作用(圖14)，其中麥角甾醇對小麥全蝕病菌的抑制作用最強，達66.70%，與陽性對照多菌靈溶液對小麥全蝕病菌的抑制率(68.09%)相當。

表2 3種化合物對小麥全蝕病菌的抑菌活性

注：表中所列數(shù)據(jù)為3個重復的平均值，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

A.無菌水(陰性對照)；B.麥角甾醇；C.對羥基苯甲酸；D.75%多菌靈可濕性粉劑800倍液(陽性對照)

3 結論與討論

本研究從厚樸內(nèi)生黑孢霉HPFJ3液體發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體的甲醇提取物中分離鑒定了3個化合物，分別為麥角甾醇、對羥基苯甲酸、4-羥基-18碳酸。黑孢霉屬(Nigrospora)真菌在多種植物體內(nèi)廣泛存在[19-21]，能夠產(chǎn)生多種活性代謝產(chǎn)物， 如從藥用植物紅豆杉中分離得到的內(nèi)生黑孢霉菌株能產(chǎn)生紫杉醇[19]，從一種蕨類植物分離的稻黑孢霉可產(chǎn)生具有抗細菌活性的蒽醌類化合物卷線孢菌素[22]，且卷線孢菌素已作為重要的生防化合物應用于植物病害的防治。本試驗中，對上述3種化合物進行抑菌活性測試發(fā)現(xiàn)，麥角甾醇、對羥基苯甲酸對小麥全蝕病菌具有抑菌活性，且麥角甾醇的抑菌活性較顯著，對小麥全蝕病菌的抑菌率達到66.70%。相關研究報道[23]，麥角甾醇大量存在于食藥用菌中，是微生物細胞膜的重要組成部分，也是一種極其重要的醫(yī)藥化工原料，可以用來生產(chǎn)黃體酮、可的松等藥物。本試驗首次發(fā)現(xiàn)麥角甾醇對小麥全蝕病菌有較強的抑菌作用，產(chǎn)生這一現(xiàn)象可能是因為麥角甾醇在和植物病原真菌互作的過程中形成氧化產(chǎn)物-麥角甾醇過氧化物，這種過氧化物具有促進腫瘤細胞凋亡、抗炎、抗氧化等藥理作用[24-26]，從而在一定程度上抑制小麥全蝕病菌的生長。該推測有待于進一步的研究證明。

黑孢霉屬真菌能夠產(chǎn)生比較豐富的生物活性物質(zhì)，是發(fā)現(xiàn)活性代謝產(chǎn)物的主要真菌類群之一[19-22]。本試驗表明，厚樸內(nèi)生黑孢霉HPFJ3 發(fā)酵菌絲體含有具抑菌活性的化合物麥角甾醇、對羥基苯甲酸。此外，在研究過程中由于一些代謝產(chǎn)物含量較低或其組成較為復雜，不能對其進行有效地分離和結構鑒定，因此，在后續(xù)試驗中還需進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，并盡可能采用精確的分離純化技術，深入挖掘HPFJ3次生代謝產(chǎn)物中的活性物質(zhì)，以促進該類真菌資源及其活性代謝產(chǎn)物的開發(fā)與應用。

[1] 劉亞飛,劉振東,郭瑞林.小麥全蝕病抗病性研究進展及其育種途徑探討[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2012,41(9):6-9.

[2] 彭娟.小麥內(nèi)生細菌對小麥全蝕病的生物防治研究[D].開封:河南大學,2008.

[3] 孫輝.植物內(nèi)生真菌多樣性及其共生作用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2012(18):143-145.

[4] W?li P R,Helander M,Saloniemi I,etal.Variable effects of endophytic fungus on seedling establishment of fine fescues[J].Oecologia,2009,159(1):49-57.

[5] Ghimire S R,Charlton N D,Craven K D.The mycorrhizal fungus,Sebacinavermifera,enhances seed germination and biomass production in switchgrass (PanicumvirgatumL)[J].Bioenergy Research,2009,2:51-58.

[6] Frank W,Beate A,Helmut B,etal.The endophytic fungusPiriformosporaindicareprograms barley to salt-stress tolerance,disease resistance,and higher yield[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(38):13386-13391.

[7] Istifadah N,Saleeba J A,Mcgee P A.Isolates of endophyticChaetomiumspp．inhibit the fungal pathogenPyrenophoratritici-repentisinvitro[J].Canadian Journal of Botany,2006,84(84):1148-1155.

[8] Ji Z Q,Wu W J,Wang M A,etal.Identification of fungicidal compounds from endophytic fungiFusariumproliferatumin celastrus angulatus[J].Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forest,2005,33(5):61-64.

[9] Yu H,Zhang L,Li L,etal.Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes[J].Microbiological Research,2010,165(6):437-449.

[10] Kumaresan V,Suryanarayanan T S.Occurrence and distribution of endophytic fungi in a mangrove community[J].Mycological Research,2001,105(11):1388-1391.

[11] 李凱,袁鶴.植物病害生物防治概述[J].山西農(nóng)業(yè)科學,2012,40(7):807-810.

[12] 俞婕,趙凱鵬,董飛,等.野生鐵皮石斛內(nèi)生菌的分離及促生作用研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2010(9):96-97.

[13] 張淑潔,鐘凌云.厚樸化學成分及其現(xiàn)代藥理研究進展[J].中藥材,2013,36(5):838-843.

[14] 李慧.厚樸中有效成分活性檢測及結構鑒定[D].大連:遼寧師范大學,2010.

[15] 丁婷,邵穎,樊美珍.中國被毛孢發(fā)酵液中一種鎮(zhèn)靜催眠活性物質(zhì)的分離純化和結構鑒定[J].菌物學報,2008,27(6):956-963.

[16] 趙淑莉,任飛娥,劉金亮,等.玉米大斑病生防放線菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].微生物學報,2012,52(10):1228-1236.

[17] 孫微微,丁婷.杜仲內(nèi)生真菌中抗蘋果炭疽病活性菌株的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報,2013,40(6):981-987.

[18] 孫微微.杜仲內(nèi)生真菌的分離純化及活性菌株在小麥中的定殖研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學,2014.

[19] Ruiz-Sanchez J,Flores-Bustamante Z R,Dendooven L,etal.A comparative study of Taxol production in liquid and solid-state fermentation withNigrosporasp.a fungus isolated fromTaxusglobosa[J].Journal of Applied Microbiology,2010,109(6):2144-2150.

[20] Xu J,Aly A H,Wray V,etal.Polyketide derivatives of endophytic fungusPestalotiopsissp.isolated from the Chinese mangrove plantRhizophoramucronata[J].Tetrahedron Letters,2011,52(1):21-25.

[21] Lopes A A,Pupo M T.Biosynthesis of aphidicolin proceeds via the mevalonate pathway in the endophytic fungusNigrosporasphaerica[J].Journal of the Brazilian Chemical Society,2011,22(1):80-85.

[22] Tanaka M,Fukushima T,Tsujino Y,etal.Nigrosporins A and B,new phytotoxic and antibacterial metabolites produced by a fungusNigrosporaoryzae[J].Bioscience,Biotechnology and Biochemistry,1997,61(11):1848-1852.

[23] 樊曉飛.食藥用菌中麥角甾醇的免疫活性及其VD轉化[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學,2013.

[24] Takei T,Yoshida M,Ohnishi-Kameyama M,etal.Ergosterol peroxide,an apoptosis-inducing component isolated fromSarcodonaspratus(Berk.) S.Ito[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2005,69(1):212-215.

[25] Kobori M,Yoshida M,Ohnishi-Kameyama M,etal.Ergosterol peroxide from an edible mushroom suppresses inflammatory responses in RAW264.7 macrophages and growth of HT29 colon adenocarcinoma cells[J].British Journal of Pharmacology,2007,150(2):209-219.

[26] Kim S W,Park S S,Min T J,etal.Ergosterol peroxide (5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol) inArmillariellamellea[J].Bulletin of Korean Chemical Society,1999,20(7):819-823.

Isolation and Identification of Antifungal Compounds from the Mycelium of Magnolia officinalis Endophytic Fungus HPFJ3

JIANG Huanian

(College of Ecology,Lishui University,Lishui 323000,China)

The methanol extract of the mycelium ofMagnoliaofficinalisendophytic fungusNigrosporasp.HPFJ3 having antifungal activity was analyzed to promote exploitation ofMagnoliaofficinalisendophytic fungi resources.By means of bioactivity guided isolation by column chromatography and high performance chromatography,three pure compounds were obtained,which were identified as ergosterol,p-hydroxybenzoic acid,4-hydroxy-18 carbonic acid respectively with the methods of MS and NMR.Antifungal activities of the three pure compounds were traced,and the results showed that ergosterol and p-hydroxybenzoic acid exhibited antifungal activity,and ergosterol showed stronger activity againstGaeumannomycesgraminiswith inhibition rate of 66.70%.However,the compound 4-hydroxy-18 carbonic acid showed no inhibitory effect.

endophytic fungi;Nigrospora;Gaeumannomycesgraminis; chemical constituent; structural identification; antifungal activity

2016-08-01

浙江省自然科學基金項目(LY13C140005)

姜華年(1965-)，男，浙江遂昌人，副教授，碩士，主要從事植物栽培基礎科學的教學與研究。 E-mail:jhn2585736@163.com

時間：2016-11-25 14∶24∶33

S476;O657

A

1004-3268(2016)12-0082-07

網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.030.html