任春霞，馬錦琪，呂祝武，婁雪玲，呂 蓓，楊 恭

1江蘇省無錫市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 無錫 214023；

2河南省鄭州市人民醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450003；

3復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032；

4復(fù)旦大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院中心實驗室，上海200240

IL-6通過活化STAT3/Notch信號促進癌相關(guān)成纖維細胞衰老及宮頸癌上皮細胞侵襲與放療抵抗的機理研究

任春霞1，馬錦琪1，呂祝武1，婁雪玲2，呂 蓓1，楊 恭3,4

1江蘇省無錫市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 無錫 214023；

2河南省鄭州市人民醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450003；

3復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032；

4復(fù)旦大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院中心實驗室，上海200240

背景與目的：腫瘤微環(huán)境中衰老的癌相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)介導(dǎo)上皮腫瘤的轉(zhuǎn)移和放化療抵抗，而CAFs分泌的炎性細胞因子IL-6可能促進宮頸癌的侵襲和放療抵抗，但其作用機制并不清楚。該研究旨在探討IL-6對CAFs衰老及宮頸癌上皮細胞侵襲與放療抵抗的作用。方法：以宮頸癌CAFs、宮頸組織正常成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)、宮頸癌細胞系HeLa、Siha和ME180為材料，采用IL-6、STAT3和Notch抑制劑處理不同細胞，用細胞染色、免疫熒光、蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)和流式細胞術(shù)等方法測定細胞衰老、STAT3、Notch信號、細胞侵襲能力和對放射線誘導(dǎo)的細胞凋亡變化。結(jié)果：CAFs條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)或IL-6可以激活STAT3和Notch信號誘導(dǎo)細胞衰老或促進宮頸癌細胞的侵襲能力；CAFs與宮頸癌細胞混合培養(yǎng)能促進宮頸癌細胞的侵襲，但IL-6抗體、STAT3抑制劑S31-201或Notch抑制劑DAPT處理細胞則會抑制宮頸癌細胞的侵襲。IL-6/STAT3作為Notch信號的上游分子，可能主要通過自分泌或旁分泌的方式上調(diào)成纖維細胞或癌細胞中Notch信號關(guān)鍵配體Jagged-1而活化Notch信號，最后賦予宮頸癌細胞對放射線的抵抗作用。結(jié)論：CAFs在腫瘤微環(huán)境中可能通過IL-6/STAT3活化Notch信號誘導(dǎo)宮頸癌上皮細胞的侵襲和放療抵抗，靶向STAT3/Notch信號相關(guān)分子有可能提高宮頸癌的放療效果。

癌相關(guān)成纖維細胞；白細胞介素6；衰老；STAT3；Notch；放射抵抗

宮頸癌發(fā)病率高，盡管高危人類乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HPV)引起宮頸癌的發(fā)病機制和相關(guān)疫苗已開始普及使用［1］，但中、晚期宮頸癌，尤其是轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)性宮頸癌在治療上仍存在困難。原發(fā)性宮頸癌對放療的敏感性較高，但放療對復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性宮頸癌的效果尚不理想［2］。

白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)是炎性細胞因子家族中的一個成員，其主要通過自分泌或旁分泌途徑作用于細胞受體，促進細胞-細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與交換從而完成各種細胞的生物學(xué)功能［3］。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，IL-6可以誘導(dǎo)宮頸癌間質(zhì)成纖維細胞的衰老，而衰老的癌相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)在早期進一步釋放大量炎性細胞因子包括IL-6，其通過自分泌途徑促進CAFs衰老，或通過旁分泌途徑作用于宮頸癌上皮細胞促進宮頸癌的生長和放化療抵抗［4］，但衰老的CAFs分泌的IL-6促進上皮癌細胞對化療抵抗的機制并不清楚。本研究旨在深入探討這一可能機制，為提高宮頸癌放療效果尋求潛在的靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞系和培養(yǎng)基

宮頸癌細胞系HeLa、Siha和ME180來自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DEME(購自美國Gibco公司)，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

CAFs和宮頸組織正常成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)來自無錫市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科2013年3月—11月收治的4例患者?；颊呔鶠槌踔位颊?。CAFs獲取源為1例宮頸癌Ⅰb1期子宮切除術(shù)患者標本和1例宮頸癌Ⅰa1期全子宮切除術(shù)患者；NFs來自兩例卵巢癌行全子宮及附件切除術(shù)患者。標本獲取前均與患者簽署書面知情同意書，符合倫理要求。成纖維細胞的分離和鑒定方法參照參考文獻［4-5］。

1.2 β半乳糖苷酶活性檢測與IL-6水平測定

衰老相關(guān)β-半乳糖染色和細胞培養(yǎng)基中IL-6的測定分別用文獻報道的方法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(購自美國R&D System公司)。具體操作步驟參照參考文獻［4］或試劑盒操作說明。

1.3 條件培養(yǎng)基收集和細胞處理

將CAFs、NFs或?qū)m頸癌細胞在100 mm培養(yǎng)皿中進行正常單層培養(yǎng)至75%的密度，然后更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基即為條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)。PBS或無血清培養(yǎng)基作為對照。

將HeLa、Siha、ME180和NF2細胞在35 mm培養(yǎng)皿中正常培養(yǎng)至75%的密度，然后用含CAFs的CM或500 ng/mL的IL-6(無血清)處理細胞48 h后收集上清液和細胞樣品。用STAT3抑制劑VI S31-201(10 μmol/L)或Notch抑制劑DAPT(20 μmol/L)(購自美國Selleck公司)處理細胞，用PBS、鼠IgG或DMSO處理的細胞作為對照組。采用蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測或細胞侵襲試驗對收集的樣品進行檢測。

1.4 Western blot檢測

采用Western blot對STAT3、pSTAT3(Tyr 705)、Notch1/2/3(細胞內(nèi)活性片段)、Jagged-1、Hes1、E-cadherin、N-cadherin、MMP9和β-actin等蛋白進行檢測?？贵w均購自美國Cell Signaling Technology公司和Sigma公司。將細胞用蛋白裂解緩沖液RIPA［25 mmol/L Tris-HCl (pH為7.6)、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、1%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS及適量蛋白酶抑制劑混合物(購自美國Sigma公司)裂解后，用BCA法測定蛋白濃度(試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司)，然后用6×的SDS加樣緩沖液(125 mmol/ L的pH為6.8的Tris-HCl、2%SDS、20%甘油和0.2%的溴酚藍)制備成適當(dāng)濃度的樣品。樣品分離前，于100 ℃溫育樣品3～5 min。然后用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解的蛋白樣品。之后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并用10%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h。此后依次加入一抗和HRP(辣根氧化物酶)-偶聯(lián)的二抗(依一抗而定)。轉(zhuǎn)移的蛋白用化學(xué)發(fā)光底物(ECL購自美國Millipore公司)進行顯色后，用LAS4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀曝光顯出條帶。

1.5 細胞侵襲實驗

帶有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室購自美國BD公司。首先將Matrigel基質(zhì)膠(50 mg/L)和無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶3的比例進行混合。在小室上室鋪100 μL混合好的Matrigel基質(zhì)膠，于37 ℃無菌環(huán)境中保持過夜，確保Matrigel基質(zhì)膠充分凝固。收集對數(shù)生長期的細胞，將宮頸癌細胞與CAF2或NF2按20∶1的比例混合后用無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，每孔加入100 μL細胞懸液于上室，設(shè)3個復(fù)孔；下室每孔加600 μL無血清DMEM培養(yǎng)基。置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中溫育16 h后取出小室, 濾膜用4%多聚甲醛固定20 min。用棉簽小心擦去未侵襲的濾膜表面細胞，結(jié)晶紫染色，在光鏡下隨機選5個視野，計算細胞總數(shù)，以穿過Matrigel基質(zhì)膠的細胞數(shù)來表示腫瘤細胞的侵襲能力。本實驗重復(fù)3次。

1.6 細胞免疫熒光實驗

將相關(guān)處理細胞收集后混懸于PBS，在蓋玻片上滴取少許細胞，用冷的無水甲醇固定3～5 min，PBS洗滌；再用0.5%的Triton X-100通透細胞5 min，PBS洗滌；然后用含10%胎牛血清和0.5%馬血清的PBS室溫封閉2～12 h之后加入pSTAT3(Tyr705)或Notch3(NICD3)一抗(1∶50稀釋)室溫溫育2～8 h，用PBST(含0.2%吐溫20)洗滌10次；再用二抗(1∶100稀釋)室溫溫育0.5～1.0 h，最后用PBST洗滌后用含DAPI的封片劑封片，用Olympus倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.7 細胞放射線處理與細胞凋亡測定

選宮頸癌細胞系HeLa用IL-6、S31-201和DAPT處理48 h后，用18 Gy的γ射線照射，12 h后收集細胞，用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。實驗和檢測方法參照參考文獻［6］。

細胞凋亡的檢測用Annexin-ⅤFITC/PI試劑盒(購自美國BD公司)。取5×105個細胞，充分洗滌后用試劑盒專用緩沖液100 μL懸浮細胞，加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC和5 μL的PI，避光室溫15 min，流式細胞儀激發(fā)光波長為512 nm，用波長515 nm通帶濾器檢測FITC熒光，并采用另一波長大于560 nm檢測PI染色。

2 結(jié) 果

2.1 成纖維細胞的鑒定及其STAT3/Notch的活化測定

從高危型HPV16/18或非高危型HPV感染的臨床宮頸癌組織和正常宮頸組織中分離和鑒定CAFs和NFs，分別建立2株CAFs和2株NFs原代細胞系。結(jié)果顯示，IL-6分泌水平在CAF中比NF中明顯高；而不同傳代次數(shù)(P5)的細胞中衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性和p16的表達隨傳代次數(shù)增加而增加；宮頸癌組織中STAT3 Tyr705磷酸化和Notch1、Notch2及Notch3切割水平比正常組織中有明顯增加(圖1)。

2.2 IL-6誘導(dǎo)細胞衰老和激活STAT3/Notch信號

發(fā)現(xiàn)用CAFs-CM或500 ng/mL的IL-6分別處理NF2、高危型HPV感染的宮頸癌細胞系HeLa(含HPV18)和Siha(含HPV16)，以及無高危型HPV感染的宮頸癌細胞系ME180細胞系后，NF2的β-半乳糖苷酶活性和p16表達增高，而腫瘤細胞中STAT3Tyr705磷酸化和Notch1、Notch2及Notch3的切割水平相對加強，而用鼠源IgG或IL-6中和抗體處理的細胞這些現(xiàn)象消失(圖2)。

圖 1 CAFs和NFs特性鑒定Fig. 1 Identification of CAFs and NFs

圖 2 細胞經(jīng)過CAF-CM或IL-6處理后的變化Fig. 2 Alterations of cells treated with CAF-CM or IL-6

2.3 STAT3與Notch的活化促進宮頸癌細胞的侵襲

本研究采用CAFs或NFs分別與宮頸癌細胞系混合培養(yǎng)，比較在無CAFs、NFs條件下，宮頸癌細胞侵襲的變化情況。結(jié)果顯示，混合培養(yǎng)(20∶1)，尤其是CAF與宮頸癌細胞HeLa混合培養(yǎng)時宮頸癌細胞的侵襲能力顯著加強；但是在混合培養(yǎng)的細胞中加入IL-6中和抗體后，HeLa細胞的侵襲能力明顯下降(圖3A)。本研究同時使用了STAT3抑制劑VI S31-201或Notch抑制劑DAPT處理宮頸癌細胞Siha+CAF2，發(fā)現(xiàn)這些抑制劑確實可以降低Siha細胞的侵襲能力(圖3B)。采用Western blot檢測的結(jié)果顯示，IL-6可以通過STAT3上調(diào)Notch信號激活的主要配體之一Jagged-1及下游信號分子Hes1而激活Notch信號途徑，同時對細胞侵襲相關(guān)標志物也有促進表達的作用(圖3C)，充分說明STAT3信號與Notch信號的相互作用是二者激活后促進宮頸癌細胞侵襲的主要信號。

2.4 IL-6通過STAT3和Notch3進入細胞核活化增強宮頸癌細胞的放療抵抗

本研究首先用細胞免疫熒光試驗，發(fā)現(xiàn)IL-6處理宮頸癌細胞后，pSTAT3(Tyr)和Notch3的通過進入細胞核增強了活化。同時對Siha細胞用STAT3抑制劑(S31-201)或Notch抑制劑(DAPT)處理后進行了18 Gy的g射線照射，結(jié)果顯示，IL-6促進Siha細胞對放射線的抵抗，而在IL-6處理的細胞中再加入STAT3或Notch抑制劑則可以促進放射線對Siha細胞的殺傷作用(圖4)。

圖 3 宮頸癌細胞侵襲能力及相關(guān)信號改變Fig 3 Alterations of invasion and cell signaling of cervical cancer cells

圖 4 細胞免疫熒光和放射線誘導(dǎo)細胞凋亡的檢測Fig. 4 Cell immunofluorescence and apoptosis induced by γ-irradiation

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中的CAFs比NFs分泌的IL-6水平高，而且兩者之間的pSTAT3和Notch信號的活化存在明顯差異。進一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可能通過STAT3信號活化Notch信號，不但能夠促進腫瘤細胞的侵襲性，而且增強宮頸癌細胞對放射線照射的抵抗性，而抑制宮頸癌細胞中STAT3或Notch信號則可以增敏放療效果，促進細胞凋亡。此外，IL-6通過自分泌或旁分泌方式上調(diào)CAFs或?qū)m頸癌細胞的Jagged-1表達，而其可能在初始階段作為Notch信號激活的細胞供體，從腫瘤微環(huán)境中開啟Notch信號在宮頸癌細胞中的全面活化。 有研究報道，CAFs在酸性條件(pH為5.2)下，衰老相關(guān)β半乳糖苷酶活性上升，因而一般呈衰老狀態(tài)［4,7］。盡管如此，但由于衰老細胞分泌大量衰老相關(guān)表型包括IL-8、Gro-1或IL-6等，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有促進作用［7-8］。因此，研究CAFs在腫瘤微環(huán)境中對上皮惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的侵襲及放化療抵抗可能具有重要臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，CAFs作為微環(huán)境中IL-6分泌的主要來源，通過活化STAT3/Notch信號對宮頸癌細胞的侵襲和放療抵抗起著至關(guān)重要的作用。

Notch信號活化是干細胞自我更新的主要信號之一，而最近的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch活化可以促進惡性間質(zhì)細胞［9］或膠質(zhì)瘤干細胞分化［10］。在宮頸癌中，Notch信號與宮頸癌放射敏感性的研究報道很少，Bajaj等［11］研究發(fā)現(xiàn)，CD66(+)細胞可能是Notch信號活化的特征，因而靶向該分子的治療可能會有效治療宮頸癌的轉(zhuǎn)移；而Liu等［12］利用抑制Notch信號的另一配體delta樣配體4(Delta like ligand 4，DLL4)，同時進行離子輻射，發(fā)現(xiàn)可以促進腫瘤壞死而抑制腫瘤的生長，但卻與腫瘤細胞中DLL4的表達量無關(guān)。這些結(jié)果并未徹底揭示Notch在宮頸癌細胞中活化的真正機制。另一方面，由于腫瘤組織對放射線的敏感性大多決定于細胞DNA損傷修復(fù)的能力，因此Notch信號活化對宮頸癌的放療抵抗是否也是通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)機制。Vermezovic等［13］最近研究發(fā)現(xiàn)，Notch1可以直接與DNA修復(fù)蛋白ATM結(jié)合抑制其激酶活性，乳腺癌中Notch1和ATM活化是反向調(diào)節(jié)的，但是Notch1抑制ATM活化可以促進Notch1驅(qū)動的白血病細胞對DNA損傷的耐受。更深入的研究發(fā)現(xiàn)，線蟲中Notch信號相關(guān)分子CEP-1可能在離子輻射過程中介導(dǎo)CEP-1調(diào)控其靶向基因egl-1的活性，而沉默bec-1基因表達促進了CEP-1依賴型的生殖細胞死亡及DNA損傷［14］。

本試驗的結(jié)果證實，CAFs通過旁分泌IL-6激活STAT3/Notch信號通路，誘導(dǎo)宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移和放療抵抗，今后尚需在動物體內(nèi)和人體宮頸癌組織標本中進行相關(guān)驗證，而且IL-6如何上調(diào)Jagged-1基因表達，以及活化的Notch信號如何通過調(diào)控腫瘤細胞DNA損傷修復(fù)功能誘導(dǎo)其對放射線的抵抗，尚有待進行深入的研究。本研究的結(jié)果初步揭示在宮頸癌微環(huán)境中，CAFs對宮頸癌放射治療的重要性，靶向STAT3/ Notch的小分子藥物可能是宮頸癌放射線治療增敏的有效途徑。

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Mechanistic study of cancer-associated fibroblast senescence and cervical cancer cell invasiveness and radio-resistance conferred by IL-6 through activation of STAT3 and Notch signaling

REN Chunxia1, MA Jinqi1, Lü Zhuwu1, LOU Xueling2, Lü Bei1, YANG Gong3,4,5(1. Department of Gynecology and Obstetrics, The People’s Hospital of Wuxi, Jiang Su, 214023; 2. Deparment of Gynecology, The People’s Hospital of Zhengzhou, Henan, 450003; 3. Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, 200032; 4. Central Laboratory, The Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai, 200240)

Background and purpose:Senescent cancer-associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment are known to mediate the invasion and radio- or chemo-resistance of epithelial cancers. The inflammatory cytokine IL-6 derived from CAFs may promote the invasion and radio-resistance of epithelial cervical cancer. However, the detailed mechanism is not clear. This study aimed to investigate the effects of IL-6 on CAFs senescence, cervical cancer cell invasiveness and radio-resistance.Methods:CAFs from cervical cancer, normal fibroblasts (NFs) from normal cervical tissues, and cervical cancer cell lines including HeLa, Siha and ME180 were used in this study. Differenttreatments of cells with IL-6 and inhibitors of STAT3 and Notch were conducted to investigate the alterations of cellular senescence, STAT3/Notch signaling, cell invasiveness, and radiotherapy-induced apoptosis by using cell staining, immunofluorescence, Western blot, and flow cytometery.Results:This study found that the conditioned medium (CM) of CAFs or IL-6 could activate the STAT3 and Notch signaling to promote cellular senescence and cervical cancer cell invasiveness. Co-culture of cervical cancer cells HeLa or Siha along with CAFs also increased the invasiveness of cancer cells, but further treatments of cells by addition of an IL-6 antibody or the inhibitors of STAT3 (S31-201) or Notch (DAPT) blocked the cancer cell invasion. Meanwhile, this study also found that STAT3 functions at the upstream of the Notch signaling to up-regulate Jagged-1, one of the key ligands of Notch in fibroblasts or epithelial cancer cells through IL-6-mediated autocrine or paracrine pathways, which eventually confers the radio-resistance of cervical cancer cells/ tissues.Conclusion:CAFs in tumor microenvironment could induce cervical cancer cell invasiveness and radio-resistance through IL-6/STAT3-mediated Notch activation, and that targeting of the STAT3/Notch signaling-associated molecules may improve the efficacy of radiotherapy for cervical cancer.

Cancer-associated fibroblast; Interleukin-6; Senescence; STAT3; Notch; Radio-resistance

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.12.001

R737.33

A

1007-3639(2016)12-0961-07

2016-09-29

2016-11-02）

國家自然科學(xué)基金青年項目(NSFC 81402153)；無錫市衛(wèi)計委指導(dǎo)性項目(ZD201401)；南京醫(yī)科大學(xué)面上基金(2012NJMU179)。

呂 蓓 E-mail: lvbei@wuxiph.com