李 莎，張思楠，秦大斌，楊 軍，伍春蓮,3

1.西華師范大學西南野生動植物資源保護省部共建教育部重點實驗室，四川 南充 637009；

2.西華師范大學化學化工學院，四川 南充 637009；

3.西南大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點實驗室，重慶 400715

1,4-二(2-芐硒乙氧基)蒽誘導人喉癌Hep-2細胞凋亡的研究

李 莎1，張思楠1，秦大斌2，楊 軍1，伍春蓮1,3

1.西華師范大學西南野生動植物資源保護省部共建教育部重點實驗室，四川 南充 637009；

2.西華師范大學化學化工學院，四川 南充 637009；

3.西南大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點實驗室，重慶 400715

背景與目的：硒是人類生命活動中必不可少的微量元素之一，對人類健康的巨大作用是其他物質無法替代的。硒的小分子化合物1,4-二(2-芐硒乙氧基)蒽{1,4-bis［2-(benzylselanyl)ethoxy］anthracene，BSEA}具有殺菌消炎的作用，但BSEA的抗癌作用尚未見報道。該研究旨在探討B(tài)SEA誘導人喉癌Hep-2細胞凋亡及其作用機制。方法：不同濃度的BSEA處理人喉癌Hep-2細胞24 h后，采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測細胞生長抑制率；在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；Annexin Ⅴ-FITC法檢測細胞凋亡；JC-1檢測線粒體膜電位；酶標分析儀檢測caspase-3和caspase-8活性；實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白［質］印跡法(Western blot)分別檢測Bax、XIAP mRNA和蛋白表達水平。結果：BSEA處理人喉癌Hep-2細胞24 h后，BSEA對其生長抑制呈劑量依賴性，IC50為35.74 μmol/L；80 μmol/L BSEA處理的Hep-2細胞在熒光顯微鏡下可觀察到明顯的凋亡小體；磷脂酰絲氨酸外翻加??；線粒體膜電位開始下降；caspase-3活性的影響呈劑量依賴趨勢，而caspase-8活性未見顯著變化；Bax的mRNA和蛋白表達水平上升，XIAP的mRNA和蛋白表達水平下降。結論：BSEA對人喉癌Hep-2細胞生長有明顯的抑制作用，并能通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。

1,4-二(2-芐硒乙氧基)蒽；Hep-2細胞；細胞凋亡；線粒體途徑

喉癌是頭頸部最主要的癌癥之一［1］。近期，Zheng等［2］統(tǒng)計分析25類主要癌癥，我國喉癌城市患者大概是農村的兩倍，98.7%的年齡在40歲以上，男性比女性多。喉癌會嚴重影響患者的心理和生活質量，特別是溝通和飲食問題［3］。硒是生命活動的必需微量元素之一，作為“抗癌先鋒”，其小分子化合藥物已經用于治療前列腺癌［4-5］、肝癌［6］、黑色素瘤［7］和結腸癌［8-9］等，給癌癥患者帶來了希望。將硒與碳雜環(huán)以不同形式進行結合，發(fā)現(xiàn)碳雜環(huán)硒化合物對腫瘤有抑制作用。而硒唑呋喃和依布硒啉是生物活性高且毒性低的有機硒化合物，使有機硒的雜環(huán)化合物成為研究熱點［10］。1,4-二(2-芐硒乙氧基)蒽{1,4-bis［2-(benzylselanyl) ethoxy］anthracene，BSEA}是一種新合成的碳雜環(huán)硒化合物(圖1)。但BSEA對喉癌的作用機理尚未見報道。因此，本研究探討B(tài)SEA對體外培養(yǎng)的人喉癌Hep-2細胞凋亡機制，為小分子化合物抗癌機理提供新的思路。

圖 1 BSEA的化學結構式Fig. 1 Chemical structure of BSEA

1 材料和方法

1.1 藥品及試劑

BSEA由西華師范大學化學化工學院秦大斌教授提供；RPMI-1640粉末購自美國Gibco公司；Biozol RNA Kit(Biomiga EZgeneTM)購自美國Biomiga公司；線粒體膜電位檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和Caspase活性檢測試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；PrimeScriptTMRT reagent Kit購自寶生物工程(大連)有限公司；SsoFastTM Evagreen Supermix購自美國Bio-Rad公司；其余試劑均為分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)

人喉癌細胞株Hep-2購自川北醫(yī)學院生化與分子免疫研究所；人喉癌Hep-2細胞用含有10%滅活的胎牛血清(fetalbovine serum，F(xiàn)BS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液(pH=7.4)于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 BSEA的配制

BSEA用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配成100 mmol/L的母液，-20 ℃儲存。使用前，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液配成不同濃度的工作液，DMSO的終濃度不超過0.1%。

1.4 檢測細胞活性

取對數(shù)生長期的Hep-2細胞，加入不同濃度的BSEA(0、10、20、40、80和100 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后，每孔各加入四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)10 μL，培養(yǎng)4 h后，每孔再加150 μL的DMSO，振蕩10 min，用酶標儀測490 nm處的吸光度(D)值。按下式計算不同濃度的藥品對細胞的生長抑制，抑制率=(1－給藥組平均D值/對照組平均D值)×100%。

1.5 觀察細胞形態(tài)

取對數(shù)生長期的Hep-2細胞，在6孔板內預先放置滅菌蓋玻片，每孔加細胞懸液2 mL進行培養(yǎng)；待細胞在蓋玻片上貼壁良好后，加入不同濃度的BSEA(0、10、20、40、80和100 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后，取出玻片，避光滴加吖啶橙(acridine orange，AO)染色液30 μL，用PBS清洗蓋玻片2次，室溫避光溫育1～2 min，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

1.6 檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的Hep-2細胞接種于6孔板中，加入不同濃度的BSEA(0、10、20、40、80和100 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后，收集各濃度實驗組與空白對照組細胞，100×g離心5min，去上清，根據(jù)Annexin V-FITC試劑盒進行熒光觀察并拍照。

1.7 檢測線粒體膜電位

取對數(shù)生長期的Hep-2細胞接種于6孔板中，加入不同濃度的BSEA(0、10、20、40、80和100 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后，收集各濃度實驗組與空白對照組細胞，100×g離心5min，去上清，根據(jù)JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒進行熒光觀察并拍照。

1.8 檢測Caspase-3和Caspase-8的活性

不同濃度的BSEA(0、10、20、40、80和100 μmol/L)處理Hep-2細胞24 h后，收集細胞，根據(jù)caspase活力檢測試劑盒的操作方法測定caspase-3和caspase-8的活力。收集1×106個以上細胞，加入500 μL細胞裂解液，冰水浴上放置10 min，加入DTT和熒光標記底物IETD-AFC或DEVD-AFC，37 ℃反應2 h，利用試劑盒中提供的caspase-8催化產生的黃色產物pNA，作為定量caspase酶活性的標準品，發(fā)現(xiàn)顏色變化明顯時即可用酶標儀測定405 nm處的D值。

1.9 檢測細胞Bax和XIAP mRNA表達水平

總RNA的提取參照Biozol RNA Kit(Biomiga EZgeneTM)的試劑盒說明進行；反轉錄按照寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit說明進行，反轉錄結束后，將反轉錄的cDNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；由寶生物工?大連)有限公司設計合成引物，內參基因為人的ACTB和GADPH，實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)在Bio-Rad CFX96 RTFQ-PCR儀上進行?；蛞镄蛄幸姳?。

表 1 基因引物序列Tab. 1 Gene-specific primer sequence

1.10 檢測Bax和XIAP蛋白表達水平

Hep-2細胞經不同濃度的BSEA(0、10、20、40、80和100 μmol/L)處理24 h后，PBS洗2次，細胞全蛋白質提取按照上海捷瑞生物工程有限公司通用蛋白裂解抽提試劑盒說明書進行提取，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉移至PVDF膜上，麗春紅染色，室溫封閉1.5 h，PBST洗膜，Bax、XIAP及內參GAPDH一抗溫育過夜，PBST洗膜，二抗室溫輕搖溫育1～2 h，PBST洗膜，將膜置于凝膠成像系統(tǒng)下掃描檢測并分析處理。

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 BSEA抑制Hep-2細胞生長

B S E A在濃度為1 0、2 0、4 0、8 0和100 μmol/L處理Hep-2細胞24 h后，用MTT法檢測細胞活性，得到細胞生長抑制率分別是28.27%、33.64%、51.64%、59.81%和77.34%，BSEA對Hep-2細胞的IC50為35.74 μmol/L。BSEA對Hep-2細胞的增殖具有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴關系(圖2)。

圖 2 不同濃度的BSEA對Hep-2細胞的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effect on Hep-2 cells with different concentrations of BSEA

2.2 熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化

不同濃度的BSEA處理Hep-2細胞24 h后，經AO染色后，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞均有不同程度的凋亡，甚至可以看到凋亡小體?？瞻讓φ战M的正常細胞貼壁生長，多不規(guī)則形，細胞膜完整無缺損，胞體豐富飽滿，核膜完整，細胞呈綠色熒光(圖3A)。當BSEA濃度為10 μmol/L時，Hep-2細胞與對照組相比，核有微弱松散的現(xiàn)象，但核膜仍然完整，細胞呈黃綠色熒光(圖3B)；當BSEA濃度為20 μmol/L時，細胞核松散更加嚴重，細胞膜開始變形(圖3C)，隨后開始出現(xiàn)晚期凋亡細胞；當BSEA濃度為40 μmol/L時，細胞膜破裂，細胞呈橙黃色(圖3D)；當BSEA濃度為80 μmol/L時，細胞膜大量破裂，開始出現(xiàn)大量的凋亡細胞，可發(fā)現(xiàn)許多凋亡小體的出現(xiàn)，此時細胞呈現(xiàn)出橙紅色(圖3E)。隨著BSEA濃度進一步增大，當為100 μmol/L時，細胞幾乎全部死亡并且已經脫落，細胞結構不完整，熒光染色觀察時可見少數(shù)細胞碎片，呈現(xiàn)紅色熒光(圖3F)。

2.3 BSEA對細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC檢測結果顯示，隨著BSEA的濃度升高，多數(shù)細胞由發(fā)出的綠色熒光變成紅色熒光，可見細胞在低濃度藥品下多數(shù)細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，隨著濃度的增高，細胞死亡的現(xiàn)象越加明顯(圖4)。

2.4 BSEA對線粒體膜電位的影響

經JC-1熒光探針檢測，隨著BSEA的濃度增加，細胞凋亡數(shù)目的增加，細胞發(fā)出的熒光也由橘紅色變?yōu)榫G色，即線粒體膜電位逐漸降低。其中陽性對照組為線粒體膜電位完全喪失而呈現(xiàn)綠色熒光(圖5)。

2.5 BSEA對Caspase-3和Caspase-8活性的影響

Caspase活性檢測發(fā)現(xiàn)，caspase-3活性隨著藥品濃度的增加而增加，而caspase-8活性隨藥品濃度的增加未見顯著變化(圖6)。

圖 3 不同濃度的BSEA對Hep-2細胞形態(tài)的影響Fig. 3 Effects of BSEA with different concentrations on the morphology change of Hep-2 cells under fluorescence microscope

圖 4 不同濃度的BSEA對Hep-2細胞膜的影響Fig. 4 Effects of BESA with different concentrations on Hep-2 cell membrane

圖 5 不同濃度BSEA對Hep-2細胞線粒體膜電位的影響Fig. 5 Effects of BSEA with different concentrations on mitochondrial membrane of Hep-2 cells

圖 6 不同濃度BSEA對Hep-2細胞caspase-3和caspase-8活性的影響Fig. 6 Effects of BSEA with different concentrations on activity of caspase-3 and caspase-8 of Hep-2 cells

2.6 BSEA對Bax和XIAP基因在mRNA水平上表達的影響

實驗結果表明，隨著BSEA濃度的提高，Bax基因的mRNA表達量也隨之升高，而XIAP基因的mRNA表達量在降低(圖7)。

2.7 BSEA對Bax和XIAP蛋白表達量的影響

根據(jù)BCA標準曲線，算出蛋白質上樣量為35 μg。與正常對照組相比，隨著BSEA藥物濃度的增加，XIAP的蛋白表達量呈減少趨勢，而Bax的蛋白表達量呈增加趨勢，并且具有一一對應的關系，即具有正效應關系(圖8)。

圖 7 不同濃度的BSEA對Bax和XIAP基因表達量的影響Fig. 7 Effects of expression of Bax and XIAP gene with different concentrations of BSEA on Hep-2 cells

圖 8 Western blot檢測Bax和XIAP蛋白表達變化Fig. 8 The protein expression of Bax and XIAP detected by Western blot

3 討 論

硒具有明顯的抗癌效果，其碳雜環(huán)化合物的抗癌性類似于已經證明具有抗癌作用的一些金屬碳雜環(huán)化合物［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉通過超氧化物和p53依賴的線粒體途徑誘導前列腺癌細胞凋亡［12］。Chun等［13］提出，硒藥抗癌過程中survivin基因表達抑制。L-甲基-硒代半胱氨酸作為核心蛋白的調節(jié)器，能上調核心蛋白的藥物毒性，通過TIEG1阻遏物結合位點來發(fā)揮作用［14］。另有報道，CHEK-2是一種腫瘤抑制基因，含硒藥物對CHEK-2的磷酸化增加更加明顯［15］。此外，Steinbrenner等［16］認為，硒藥會引起胰島素信號級聯(lián)，導致Akt激活，并伴有下游PI3K/Akt信號通路的活化。細胞死亡有凋亡和壞死兩種形式。本研究通過MTT實驗、熒光染色觀察和Annexin V-FITC/PI等發(fā)現(xiàn)，BSEA對Hep-2細胞有明顯的生長抑制，并誘導其發(fā)生細胞凋亡。細胞凋亡途徑中死亡受體途徑和線粒體途徑是主要誘導哺乳動物細胞凋亡的途徑。經各種刺激(如DNA損傷、氧化應激、紫外線及生長因子缺乏等)誘導細胞凋亡實驗中發(fā)現(xiàn)線粒體膜的通透性會增加，釋放出其內的各種蛋白質(如Cyt-C)，線粒體膜電位降低［17］。Cyt-C釋放活化caspase-9，再激活下游的caspase-3，引起線粒體凋亡途徑的級聯(lián)反應。JC-1檢測和caspase活性檢測結果提示，BSEA可能通過線粒體途徑誘導人喉癌Hep-2細胞凋亡。細胞凋亡過程還涉及基因調控，本研究主要考察Bax和XIAP基因的表達水平。Bax是促進細胞色素c的釋放關鍵因子之一，在凋亡信號的刺激下Bax可從細胞質轉位到線粒體膜上，從而啟動線粒體凋亡途徑［18］。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是IAP家族中最強的凋亡抑制因子，在線粒體凋亡途徑中，XIAP能直接結合并抑制caspase-9、caspase-3和caspase-7，而XIAP表達的降低可能減少對caspase-9和caspase-3的抑制，最終導致細胞凋亡［19］。本研究結果顯示，BSEA可促進Bax表達，抑制XIAP表達，從而促進細胞凋亡。因此，BSEA誘導Hep-2細胞凋亡的作用機制主要是線粒體途徑。XIAP的表達對caspase-8的激活無影響，但可阻止激活caspase-3而使凋亡受體途徑的信號傳導中斷［20］。另外也可抑制caspase-3對caspase-8的正反饋激活使死亡信號不能被放大，二者共同作用的結果是阻斷受體途徑引起的細胞凋亡［21］。但本文檢測發(fā)現(xiàn)，XIAP的mRNA和蛋白表達水平下降，caspase-3的活性升高，說明BSEA不是通過死亡受體途徑誘導細胞凋亡的。因此，化合物BSEA誘導Hep-2細胞凋亡而造成細胞死亡的作用機制主要是線粒體凋亡途徑。近年來越來越多的研究者證實，細胞凋亡與細胞自噬之間存在復雜的串話。Lin等［22］研究發(fā)現(xiàn)，XIAP不僅抑制細胞凋亡，也能通過上調Beclin 1表達，再經NF-κB信號通路誘導細胞自噬的形成。因此，推測100 μmol/L劑量組mRNA表達水平比80 μmol/L劑量組高是由于有細胞自噬調控的參與，而100 μmol/L劑量組蛋白質表達水平比80 μmol/L劑量組低可能是由于細胞凋亡和細胞自噬相關蛋白之間相互作用。在本研究基礎上，有待進一步研究BSEA對細胞自噬的影響。

綜上所述，人喉癌Hep-2細胞在BSEA的作用下有不同程度的抑制，BSEA濃度越高其抑癌作用越強，并且主要通過線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡，這為小分子化合物抗癌機理提供了依據(jù)，也為其在臨床癌癥的治療中的應用提供了理論基礎和實驗依據(jù)。

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The research on apoptosis of human laryngeal cell line Hep-2 induced by 1,4-bis[2-(benzylselanyl) ethoxy] anthracene

LI Sha1, ZHANG Sinan1, QIN Dabin2, YANG Jun1, WU Chunlian1,3(1.Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation, Ministry of Education, China West Normal University, Nanchong 637009, Sichuan Province, China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering, China West Normal University, Nanchong 637009, Sichuan Province, China; 3.State Key Laboratory Breeding Base of Eco-environments and Bio-resources of the Three Gorges Reservoir Region, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Background and purpose:Selenium is one of the essential trace elements for human activities, and plays an incomparable role in maintaining human health. It was reported that selenium compound 1,4-bis［2-(benzylselanyl)ethoxy］(BSEA) anthracene has antiseptic and antiphlogistic effects. However, the mechanisms underlying anticancer effects of BSEA are rarely reported. BSEA-induced apoptosis in human laryngeal carcinoma Hep-2 cells and its mechanisms were studied.Methods:Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was used to determine inhibition ratio of Hep-2 cells 24 hours after Hep-2 cells were treated with different concentrations of BSEA. Fluorescence microscope was used to observe the morphology change of apoptosis in Hep-2 cells. The apoptosis was detected by Annexin Ⅴ-FITC. Mitochondrial membrane potential was assayed by JC-1. Microplate reader detected the activity of caspase-3 and caspase-8. The mRNA and protein levels of Bax and XIAP were measured by real-time fluorescent quantitative polymerase chainreaction (RTFQ-PCR) and Western blot.Results:The results showed that BSEA caused a dose-dependent inhibition of the growth of human laryngeal carcinoma cell line Hep-2 in vitro, and IC50was 35.74 μmol/L. The apoptotic bodies were distinctly observed at a concentration of 80 μmol/L of BSEA by AO fluorescence staining. This study found that the eversion of phosphatidyl serine intensified, and mitochondrial membrane potential also began to decline. The activity of caspase-3 appeared the tendency of dependence on dosage, while the activity of caspase-8 did not change significantly. The mRNA and protein expression level of Bax increased, whereas the mRNA and protein expression level of XIAP decreased.Conclusion:Therefore, BSEA could obviously inhibit human laryngeal carcinoma Hep-2 cells proliferation and induce apoptosis via the mitochondrial pathway.

1,4-bis［2-(benzylselanyl)ethoxy］anthracene; Hep-2 cells; Apoptosis; Mitochondrial pathway

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.12.005

R739.65

A

1007-3639(2016)12-0989-07

2016-04-26

2016-07-14）

四川省教育廳重大培育項目(13CZ0029)；中國博士后基金(2013M540391)；三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建重點實驗室開放課題基金項目(SKL-2011-05)。

伍春蓮 E-mail: wcl_xj@163.com