王靜文，龔旭昊，范強，萬仁玲

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

三種呼吸系統(tǒng)獸藥制劑中非法添加鹽酸溴己新、吲哚美辛的HPLC-PDA檢測方法的建立

王靜文，龔旭昊，范強*，萬仁玲

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為檢測麻杏石甘散、氟苯尼考注射液中非法添加的鹽酸溴己新，甘草顆粒中非法添加的吲哚美辛，以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，磷酸鹽緩沖液-乙腈(20∶80)為流動相檢測鹽酸溴己新，以乙腈-0.1mol/L冰醋酸溶液(50∶50)為流動相檢測吲哚美辛，流速為1.0 mL/min，波長掃描范圍為200～400 nm，建立了相應(yīng)的HPLC-PAD檢測方法，并采用峰純度檢查和光譜相似度檢查輔助對照品比對方法，對非法添加藥物進行確證。結(jié)果顯示，麻杏石甘散和氟苯尼考注射液中鹽酸溴己新的回收率分別為94.8%和98.5%，甘草顆粒中吲哚美辛回收率為95.2%；鹽酸溴己新線性方程為y=14780200x-16476，R=0.9999，吲哚美辛線性方程為y=10995430x+13033，R=0.9999；麻杏石甘散中鹽酸溴己新檢測限為83 mg/kg，氟苯尼考注射液中鹽酸溴己新檢測限為1.6 g/L，甘草顆粒中吲哚美辛檢測限為1 g/kg。

鹽酸溴己新；吲哚美辛；麻杏石甘散；氟苯尼考注射液；甘草顆粒

麻杏石甘散由麻黃、杏仁、石膏、甘草四味中藥組成，具有清熱，宣肺，平喘的功效，主治由細菌、病毒、支原體引起的畜禽呼吸道疾病[1]。甘草顆粒為甘草浸膏經(jīng)加工制成的顆粒。具有祛痰止咳的功效，主治咳嗽[2]。氟苯尼考為酰胺醇類抗生素，用于治療豬、雞敏感菌所致的感染[3]。三種制劑均為《中國獸藥典》2010年版收載，為獸藥臨床治療呼吸系統(tǒng)疾病的常用藥。鹽酸溴己新為祛痰藥，可直接作用于支氣管腺體，促使粘液分泌細胞的溶酶體酶釋出，裂解粘液中的粘多糖，使痰的粘稠度降低[4]，吲哚美辛為非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥，通過抑制機體內(nèi)前列腺素的合成而產(chǎn)生解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用[5]。由于缺乏殘留檢測試驗數(shù)據(jù)，為避免增加動物性食品中藥物殘留危害，農(nóng)業(yè)部公告第560號于2005年廢止了二者獸藥地方標準。然而在進行獸藥監(jiān)督抽檢工作中發(fā)現(xiàn)有在麻杏石甘散、氟苯尼考注射液中添加鹽酸溴己新，在甘草顆粒中添加吲哚美辛的情況。目前尚未有針對上述制劑建立的鹽酸溴己新、吲哚美辛HPLC-PDA非添檢測方法，參考相關(guān)文獻[6-13]并結(jié)合獸藥中非法添加檢測工作特點[14-15]，建立了簡便、快捷、可靠的檢測方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695液相系統(tǒng)、2998 PDA二極管陣列檢測器、Empower3色譜工作站軟件(美國Waters 公司)、Mettler XS205型十萬分之一天平(美國Mettler Toledo公司)、MiliQ純水機、雷磁PHSJ-4A型pH 計。

1.2 試藥與試劑 鹽酸溴己新對照品(含量：99.9%，批號：100427-201102，中國食品藥品檢定研究院)，吲哚美辛對照品(含量：99.9%，批號：100258-200904，中國食品藥品檢定研究院)供試品：麻杏石甘散空白樣品(來源：實驗室自制)，麻杏石甘散陽性樣品(批號：20140601)，氟苯尼考注射液空白樣品(批號：20140501)，氟苯尼考注射液陽性樣品(批號：14110501)甘草顆粒空白樣品(批號：20160501)甘草顆粒陽性樣品(批號：201601101)。乙腈(Merck，色譜純，批號：1747130433)，甲醇(Merck，色譜純，批號：1748007433)，磷酸二氫鉀(Johnson Matthey，分析純，批號：F21S033)，氫氧化鈉(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，20150104)，冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，20140923)，去離子水(MiliQ純化系統(tǒng)制備的去離子水)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 鹽酸溴己新色譜條件 色譜柱：資生堂 MG C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相：磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀1.0 g，加900 mL水使溶解，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，用水稀釋至1000 mL，搖勻，即得)-乙腈(20∶80)，流速：1.0 mL/min，柱溫:40℃，進樣量：10 μL，二極管陣列檢測器(PDA，檢測波長:200～400 nm，記錄249 nm波長處的色譜圖)。2.1.2 吲哚美辛色譜條件 色譜柱：資生堂MG C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.1 mol/L冰醋酸溶液(50∶50)，流速：1.0 mL/min，柱溫:25℃，進樣量：10 μL，二極管陣列檢測器(PDA，檢測波長:200～400 nm，記錄317 nm波長處的色譜圖)。

2.2 溶液制備

2.2.1 麻杏石甘散樣品溶液制備 取麻杏石甘散(空白樣品為實驗室自制)12.0 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇200 mL，超聲處理15 min，靜置，濾過。

2.2.2 氟苯尼考注射液樣品溶液制備 取氟苯尼考注射液(空白樣品為已測得不含鹽酸溴己新的氟苯尼考注射液)1.0 mL，置刻度管中，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，濾過。

2.2.3 甘草顆粒樣品溶液制備 取甘草顆粒(空白樣品為已測得不含吲哚美辛的甘草顆粒)1.0 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL，超聲處理15 min，靜置，濾過，取濾液5 mL置刻度管中，加甲醇至10 mL，搖勻，濾過。

2.2.4 鹽酸溴己新對照品儲備液 取鹽酸溴己新對照品25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，置4 ℃冰箱保存。

2.2.5 吲哚美辛對照品儲備液 取吲哚美辛對照品25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，置4 ℃冰箱保存。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性 通過麻杏石甘散空白試驗、氟苯尼考注射液空白試驗和甘草顆?？瞻自囼炁懦髦苿┨幏街兄饕煞謱τ诒粶y物的干擾。精密量取鹽酸溴己新對照品溶液(0.1 mg/mL)、麻杏石甘散空白溶液和氟苯尼考注射液空白溶液各10 μL，照2.1.1色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖和光譜指數(shù)圖，結(jié)果表明麻杏石甘散、氟苯尼考本底在鹽酸溴己新出峰處無干擾(圖1-圖3)。精密量取吲哚美辛對照品溶液(0.1 mg/mL)、甘草顆?？瞻兹芤焊?0 μL，照2.1.2色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖和光譜指數(shù)圖，結(jié)果表明甘草顆粒本底在吲哚美辛出峰處無干擾(圖4-圖5)。

圖1 鹽酸溴己新對照品(0.1 mg/mL)光譜色譜圖

圖2 麻杏石甘散空白溶液光譜色譜圖

圖3 氟苯尼考注射液空白溶液光譜色譜圖

圖4 吲哚美辛對照品(0.1 mg/mL)光譜色譜圖

圖5 甘草顆?？瞻兹芤汗庾V色譜圖

2.3.2 線性 精密量取鹽酸溴己新對照品儲備液(1.0 mg/mL)1、3、5、7、9 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.04、0.12、0.20、0.28、0.36 mg/mL的標準曲線溶液，照2.1.1色譜條件測定。按鹽酸溴己新峰面積與對應(yīng)的濃度作標準曲線，并計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。鹽酸溴己新回歸方程為y=104780200x-16476，R=0.9999。表明鹽酸溴己新在0.04～0.36 mg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系；精密量取吲哚美辛對照品儲備液(1.0 mg/mL)1、2、4、6、8 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.04、0.08、0.16、0.24、0.32 mg/mL的標準曲線溶液，照2.1.2色譜條件測定。按吲哚美辛峰面積與對應(yīng)的濃度作標準曲線，并計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。吲哚美辛回歸方程為y=10995430x+13033，R=0.9999。表明吲哚美辛在0.04～0.32 mg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 檢測限 所建方法以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢測限，并保證檢測限濃度下樣品與對照品溶液的保留時間一致(差異小于等于±5%)，最大吸收波長一致(差異小于等于±2 nm)，色譜峰的純度角度小于純度閾值，PDA匹配角度小于PDA匹配閾值。取麻杏石甘散空白樣品12 g三份，置刻度管中，分別加入鹽酸溴己新對照品溶液(1 mg/mL)適量(0.5、1.0、1.5 mL)，加甲醇至200 mL，超聲處理15min，靜置，濾過；取氟苯尼考注射液空白樣品1.0 mL三份，置刻度管中，分別加入鹽酸溴己新對照品溶液(1.6 μg/mL)適量(0.5、1.0、1.5 mL)，加甲醇至10 mL，搖勻，濾過。精密吸取上述檢測限樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照2.1.1色譜條件測定檢測限，結(jié)果表明中間加入量為鹽酸溴己新的檢測限，該色譜條件下鹽酸溴己新在麻杏石甘散樣品和氟苯尼考注射液樣品中的檢出限分別為83 mg/kg和1.6 g/L。取甘草顆?？瞻字苿?.0 g三份，置具塞錐形瓶中，分別加入吲哚美辛對照品溶液(1 mg/mL)適量(0.5、1.0、1.5 mL)，加甲醇100 mL，超聲處理15 min，靜置，濾過，取濾液5 mL置刻度管中，加甲醇至10 mL，搖勻，濾過，精密吸取上述檢測限樣品溶液10 μL，照2.1.2色譜條件注入液相色譜儀，結(jié)果表明中間加入量為吲哚美辛的檢測限，該色譜條件下吲哚美辛在甘草顆粒中的檢出限為1.0 g/kg。檢出限濃度下各化合物的純度與光譜相似度結(jié)果見表1。

表1 檢測限試驗溶液峰純度與光譜相似度結(jié)果表

2.3.4 準確度 以三種制劑的空白樣品分別加鹽酸溴己新、吲哚美辛對照品做回收率試驗來考察方法的準確度?；厥章试囼炄芤号渲疲壕芊Q取麻杏石甘散空白樣品12 g、鹽酸溴己新對照品10 mg，置同一200 mL量瓶中，加入150 mL甲醇，超聲處理15 min，靜置，放冷后，用甲醇稀釋至刻度，濾過；精密量取氟苯尼考空白樣品1.0 mL、鹽酸溴己新對照品溶液(16 μg/mL)1.0 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，平行配制上述試驗溶液各6份。精密吸取上述試驗溶液各10 μL，注入液相色譜儀，參照2.1.1色譜條件檢測。精密稱取甘草顆粒空白樣品1.0 g、吲哚美辛對照品10 mg，置同一100 mL量瓶中，加入60 mL甲醇，超聲處理15 min，靜置，放冷后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，平行配制上述試驗溶液6份。精密吸取上述試驗溶液各10 μL，注入液相色譜儀，參照2.1.2色譜條件檢測。結(jié)果顯示：麻杏石甘散中鹽酸溴己新回收率為94.8%，RSD為0.6%；氟苯尼考中鹽酸溴己新回收率為98.5%，RSD為0.2%；甘草顆粒中吲哚美辛回收率為95.2%，RSD為0.4%。

2.3.5 耐用性 以各制劑的回收率試驗溶液作為耐用性試驗溶液。從柱溫、流動相pH值、色譜柱三個方面考察鹽酸溴己新檢測方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫為30 ℃、35 ℃、40 ℃，結(jié)果表明：隨著柱溫升高，鹽酸溴己新保留時間提前，時間相差近4 min；調(diào)節(jié)流動相pH值為6.0、7.0和8.0，結(jié)果表明：在所調(diào)節(jié)范圍內(nèi)，鹽酸溴己新的保留時間差別不大；選擇三款不同品牌色譜柱(資生堂 MG，150 mm×4.6 mm，5 μm；Waters Atlantis T3，250 mm×4.6 mm，5 μm；GRACE Alltima C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)，考察不同色譜柱對檢測的影響，在所建檢測方法條件下，三種品牌色譜柱所得色譜峰的理論塔板數(shù)、對稱因子均符合規(guī)定，T3柱中，保留時間在28 min左右，資生堂 MG中，保留時間為15 min左右，本方法中，為節(jié)約分析時間，提高工作效率，建議使用短色譜柱。從柱溫、色譜柱兩個方面考察吲哚美辛檢測方法的耐用性，調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃，結(jié)果顯示：隨著柱溫升高，吲哚美辛保留時間略提前；選擇三款不同品牌色譜柱(資生堂 MG，150 mm×4.6 mm，5 μm；資生堂?C18 4.6 mm×250 mm，5 μm；GRACE Alltima C18，250×4.6 mm，5 μm)，考察不同色譜柱對檢測的影響，在所建檢測方法條件下，三種品牌色譜柱所得色譜峰的理論塔板數(shù)、對稱因子均符合規(guī)定，方法耐用性良好。

2.4 樣品測定結(jié)果 取麻杏石甘散陽性樣品照2.2.1制備方法操作，氟苯尼考注射液陽性樣品照2.2.2制備方法操作，照2.1.1色譜條件測定鹽酸溴己新含量，結(jié)果為：麻杏石甘散中鹽酸溴己新含量為0.43 g/kg，氟苯尼考注射液中鹽酸溴己新的含量為6.36 g/L。取甘草顆粒陽性樣品照2.2.3制備方法操作，照2.1.2色譜條件測定吲哚美辛含量，結(jié)果為：甘草顆粒中的吲哚美辛含量為17 g/kg。陽性樣品檢測結(jié)果見表2。

表2 陽性樣品檢測結(jié)果

3 討 論

3.1 流動相的選擇 試驗中曾考察過0.1%磷酸-甲醇(30∶70)、0.12%磷酸二氫銨-乙腈(80∶20)、醋酸溶液(取冰醋酸50 mL加水930 mL，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.4)-甲醇(30∶70)[8-10]等不同的鹽酸溴己新流動相系統(tǒng)，結(jié)果磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀1.0 g，加900 mL水使溶解，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，用水稀釋至1000 mL)-乙腈(20∶80)為流動相時，鹽酸溴己新的峰形好，麻杏石甘散和氟苯尼考本底中的化合物也不干擾測定。同時考察乙腈-0.1 mol/L冰醋酸(55∶45)、甲醇-0.5%磷酸(60∶40)、0.1 mol/L冰醋酸溶液-甲醇(20∶80)[11-13]等不同的吲哚美辛流動相系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-0.1 mol/L冰醋酸溶液(50∶50)為流動相時，吲哚美辛的峰形好，甘草顆粒本底中的化合物不干擾測定。

3.2 測定用溶劑的選擇 通過對鹽酸溴己新和吲哚美辛在甲醇中的溶解性考察，發(fā)現(xiàn)在本方法濃度范圍內(nèi)，鹽酸溴己新在甲醇中的溶解性良好?？紤]到在非法添加高通量篩查工作中以甲醇作為溶劑具有普適性，結(jié)合優(yōu)化的流動相種類、比例、柱溫等色譜條件可以排除制劑中其他共提物的干擾，故選取甲醇作為檢測用溶劑。

3.3 提取波長的選擇 鹽酸溴己新對照品在200～400 nm波長范圍最大吸收波長為207.6、248.8、307.0 nm，麻杏石甘散中甘草酸銨、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿等主要組份以及氟苯尼考在上述波長下對鹽酸溴己新的檢測均無干擾，故選取吸收系數(shù)最大的249 nm作為檢測波長；吲哚美辛對照品在200～400 nm波長范圍最大吸收波長為317.2 nm，甘草顆粒中甘草酸銨等組份在此波長下對檢測無干擾，故選取317 nm作為檢測波長。3.4 峰純度和光譜相似度 峰純度檢查可以作為判斷色譜峰是否為單一物質(zhì)峰的重要依據(jù)，光譜相似度檢查可以排除保留時間一致，但紫外光譜不同的化合物干擾，通過與對照品建立的標準物質(zhì)譜庫比較，Waters Empower工作站可以對峰純度和光譜匹配度進行計算，當純度角度小于純度閾值時，可以判定為單一物質(zhì)峰，當匹配角度小于匹配閾值時，可以判定光譜相似。在本文所建方法進行的各項檢測中，都保證了目標峰的純度角度小于純度閾值，保證了目標峰與鹽酸溴己新或吲哚美辛對照品光譜庫比較時，PDA匹配角度小于PDA匹配閾值。

4 結(jié) 論

已發(fā)布的農(nóng)業(yè)部公告中，呼吸系統(tǒng)用藥中常見的非法添加物有煙酰胺、氨茶堿、甲氧氯普胺等[16-17]，本文旨在對呼吸系統(tǒng)用藥中新發(fā)現(xiàn)的鹽酸溴己新和吲哚美辛兩種非法添加藥物建立檢測方法，為以后的未知物監(jiān)測提供信息。試驗所建立的方法中各制劑的共提物組分對檢測均無干擾，通過與對照品色譜峰的保留時間、最大吸收波長進行比對，以及峰純度檢測和光譜相似度檢查來判定制劑中是否添加了鹽酸溴己新和吲哚美辛，方法可靠、簡便、重復性好，可廣泛應(yīng)用于獸藥非法添加檢測工作。

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(編輯：陳希)

Determination of Bromhexine Hydrochloride and Indometcain Illegally Added in Three Veterinary Preparations by HPLC-PDA

WANG Jing-wen, GONG Xu-hao, FAN Qiang*, WAN Ren-ling

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

Methods for the determination of bromhexine hydrochloride in Maxing Shigan power and florfenicol injectionas well as indometcain in Gancao Granule were developed by the high performance liquid chromatography with photo-diode array detector(HPLC-PDA).It was tested with C18 column, using phosphate buffer and acetonitrile(20∶80)，0.1 mol/L acetic acid and acetonitrile(50∶50)as the mobile phases. The scanning wavelength was from 200 to 400 nm.Peak purity test and spectrum similarity test were used to identify bromhexine hydrochloride and indometcain. The mean recoveries of bromhexine hydrochloridein maxing shigan power and florfenicol injection were 94.8% and 98.5%. The mean recovery of indometcain in Gancao granule was 95.2%. The linear equations of bromhexine hydrochloride and indometcain werey=14780200x-16476(R=0.9999) andy=10995430x+13033(R=0.9999). The limit of detections of blomhexine hydrochloride in Maxing Shigan power and florfenicol injection were 83 mg/kg and 1.6 g/L. The limit of detection of indometcain in Gancao granule was 1 g/kg. In conclusion, the method is simple, accurate and reliable for the determination of bromhexine hydrochloride and indometcain in three veterinary preparations.

bromhexine hydrochloride; indometcain;Maxing Shigan power; florfenicol injection; Gancao granule

王靜文，碩士研究生，從事藥品檢驗及相關(guān)工作。

2016-08-15

A

1002-1280 (2016) 12-0045-06

S859.79