李春玲，丁亞蓮，謝文靜，牛春，張萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川，750101)

不同誘變方法對(duì)TL-15028菌株產(chǎn)泰樂(lè)菌素相關(guān)性能的影響

李春玲，丁亞蓮，謝文靜，牛春，張萍*

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川，750101)

為了選育出泰樂(lè)菌素高產(chǎn)菌株，以弗氏鏈霉菌 (Streptomycesfradiae) TL-15028菌株作為出發(fā)菌株，利用化學(xué)誘變、物理誘變以及復(fù)合誘變的方法對(duì)菌株進(jìn)行誘變處理，比較不同誘變方法的誘變效果，通過(guò)誘變篩選出1株遺傳穩(wěn)定性好、且具有泰樂(lè)菌素和豆油抗性的菌株TLEU-1503，其發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株提高了36.5%，達(dá)到14124 μg/mL，對(duì)泰樂(lè)菌素高效生產(chǎn)、品質(zhì)提升具有重要意義。

泰樂(lè)菌素；高產(chǎn)菌株；復(fù)合誘變；選育

泰樂(lè)菌素(Tylosin)是一種16元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)禽畜專(zhuān)用抗生素，主要由弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)產(chǎn)生，可有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌、某些革蘭氏陰性球菌、支原體、分枝桿菌、螺旋體及原蟲(chóng)等微生物的生長(zhǎng)，對(duì)豬流行性肺炎、雞敗血癥等多種常見(jiàn)疾病有著獨(dú)特的療效[1-3]。同時(shí)，泰樂(lè)菌素還可以促進(jìn)禽畜生長(zhǎng)，提高飼料利用率，縮短飼養(yǎng)周期，提高經(jīng)濟(jì)效益[4]。泰樂(lè)菌素高效、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性，被廣泛用作獸藥和飼料添加劑，也是國(guó)家規(guī)劃重點(diǎn)發(fā)展的獸藥產(chǎn)品[5-7]。但是，目前國(guó)內(nèi)泰樂(lè)菌素基礎(chǔ)與應(yīng)用研究方面較弱，特別是生產(chǎn)菌種的效價(jià)遠(yuǎn)不及國(guó)外水平，嚴(yán)重阻礙了泰樂(lè)菌素產(chǎn)量和品質(zhì)的提升。開(kāi)展泰樂(lè)菌素高產(chǎn)菌株的選育是提高泰樂(lè)菌素產(chǎn)量的關(guān)鍵，因此，本研究利用化學(xué)誘變、物理誘變及兩者結(jié)合的方法對(duì)菌株進(jìn)行誘變處理，定向選育出具有泰樂(lè)菌素、豆油抗性的高產(chǎn)穩(wěn)定性菌株，為進(jìn)一步提高泰樂(lè)菌素的產(chǎn)量和品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 出發(fā)菌為弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)TL-15028菌株，由寧夏泰瑞制藥有限公司技術(shù)中心保存。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，恒溫大幅振蕩搖床(HQL150C，武漢科學(xué)儀器廠(chǎng))、恒溫培養(yǎng)箱(LHP160，江蘇杰瑞爾電器有限公司)、分光光度計(jì)(BECKMANDU-600)、高效液相色譜系統(tǒng)(Watesr)。

1.2 方法

1.2.1 誘變前準(zhǔn)備

1.2.1.1 培養(yǎng)基配制 試管斜面與平皿培養(yǎng)基: 含玉米淀粉，NH4NO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，NaCl，F(xiàn)eSO4·7H2O，瓊脂。種子搖瓶培養(yǎng)基：含豆餅粉，精油，酵母粉，玉米漿，重質(zhì)CaCO3。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基：含魚(yú)粉，玉米淀粉，精油，甜菜堿鹽酸鹽，K2HPO4，NiSO4·6H2O，MgSO4·7H2O，輕質(zhì)CaCO3，KCl，NaCl。pH調(diào)至7.2，121℃滅菌15 min，備用。

1.2.1.2 培養(yǎng)條件 在黑暗、溫度29 ℃、相對(duì)濕度40%條件下培養(yǎng)，試管斜面培養(yǎng)9 d，平皿培養(yǎng)18 d，種子搖瓶轉(zhuǎn)速220 r/min、培養(yǎng)48 h，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速220 r/min、培養(yǎng)6 d。

1.2.1.3 菌種復(fù)壯 取保藏的斜面試管，倒入6 mL無(wú)菌生理鹽水，用接種環(huán)刮取培養(yǎng)物表面的孢子，使其懸浮，再用脫脂棉過(guò)濾，將濾液倒入離心管中，5000 r/min離心2 min，棄上清液，然后加入5 mL生理鹽水，用移液器反復(fù)吸打沉淀物，倒入三角錐形瓶(型號(hào)為100 mL，瓶中裝有15粒玻璃珠) 中，再用5 mL生理鹽水沖洗離心管2次，一并倒入錐形瓶，29 ℃，220 r/min震蕩15 min，過(guò)濾得到孢子懸浮液。將孢子懸浮液用稀釋至1×10-4，每個(gè)平板加入200 μL孢子懸浮液，涂布均勻，培養(yǎng)后挑取單菌落，先進(jìn)行抑菌圈初篩，然后搖瓶復(fù)篩。

1.2.2 誘變方法

1.2.2.1 紫外(UV)誘變處理 參照張明明等[8]的方法，并做了一定改進(jìn)。誘變處理時(shí)間分別為0 s(對(duì)照)、15 s、30 s、60 s、90 s。誘變結(jié)束后，在黑暗中放置1 h，吸取孢子懸浮液，梯度稀釋?zhuān)坎计桨?，?9 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 d。

1.2.2.2 甲基磺酸乙酯(EMS)誘變處理 參照徐紅梅等[9]的方法，并做了一定改進(jìn)。誘變處理時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，吸取誘變后的孢子懸浮液梯度稀釋?zhuān)坎计桨?，?9 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18 d。

1.2.2.3 LiCl+UV復(fù)合誘變處理 吸取5 mL孢子懸浮液置于50 mL三角瓶?jī)?nèi)，加入1%的 LiCl，放置在搖床間振蕩4 h，然后經(jīng)UV誘變處理60 s，梯度稀釋?zhuān)坎计桨澹?9 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18 d。

1.2.2.4 EMS+UV復(fù)合誘變處理 吸取5 mL孢子懸浮液于50 mL三角瓶中，加入15 μL EMS，放置于29 ℃，220 r/min搖床間震蕩4 h，然后經(jīng)UV誘變處理60 s，梯度稀釋?zhuān)坎计桨?，?9 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18 d。

1.2.3 性能檢測(cè)

1.2.3.1 泰樂(lè)菌素效價(jià)測(cè)定 參照Choi等[10]的方法，并做了一定改進(jìn)。采用HPLC法，色譜柱為ODS柱，流動(dòng)相為0.85 mol /L氯化鈉、40%乙腈溶液，用l mol/L的鹽酸調(diào)pH至2.5，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；待測(cè)效價(jià)=(標(biāo)準(zhǔn)品的單位×待測(cè)樣品的峰面積×待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù))/標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。

1.2.3.2 致死率和正突變率 每個(gè)處理30皿，重復(fù)3次，以未做誘變處理的孢子懸浮液作為對(duì)照，致死率=(對(duì)照處理平板菌落-誘變處理平板菌落)/對(duì)照處理平板菌落×100%。正突變率=誘變處理后效價(jià)高于對(duì)照5%的菌株數(shù)/誘變處理后菌株總數(shù)×100%。1.2.3.3 菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將高產(chǎn)菌株進(jìn)行斜面保存，并連續(xù)傳代 3次，采用搖瓶發(fā)酵法測(cè)定每一代菌株泰樂(lè)菌素效價(jià)，分析遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3.4 菌株泰樂(lè)菌素抗性的檢測(cè) 孢子懸液稀釋后涂布于含有15000 μg/mL泰樂(lè)菌素的平板上，于29 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18 d，檢測(cè)菌株的泰樂(lè)菌素抗性。

1.2.3.5 菌株豆油抗性的檢測(cè) 將孢子懸液稀釋后涂布于含有4%豆油的平板上，以不含豆油的平板為對(duì)照，于29 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18 d，檢測(cè)菌株的豆油抗性。發(fā)酵液中豆油殘量的測(cè)定具體參照徐紅梅[9]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘變方法誘變影響的比較 原始菌株復(fù)壯培養(yǎng)后，選取編號(hào)TL-15028的菌株為原始出發(fā)菌株，分別采用UV、EMS、LiCl+UV、EMS+UV誘變方法進(jìn)行誘變處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用UV誘變，隨著處理時(shí)間增加，菌體致死率、正突變率顯著升高，90 s的致死率最高，達(dá)到89.1%；60 s的致死率為68.3%，正突變率與90 s無(wú)顯著差異，且效價(jià)最高(表1)。采用UV處理60 s，利用瓊脂柱法進(jìn)行初篩，得到11株正突變株，通過(guò)發(fā)酵搖瓶法復(fù)篩后，得到2株編號(hào)為T(mén)LU-1501、TLU-1502的菌株，其效價(jià)分別為12854、12973 μg/mL。

采用EMS誘變，隨著處理時(shí)間增加，菌體致死率、正突變率顯著升高，5 h的致死率最高，達(dá)到93.7%；4 h的致死率為66.1%，正突變率與5 h無(wú)顯著差異，且效價(jià)最高(表1)。采用EMS處理4 h，得到1株編號(hào)為T(mén)LE-1501的優(yōu)良菌株，其發(fā)酵效價(jià)為12767 μg/mL。

采用LiCl+UV復(fù)合誘變，得到23株正突變株，復(fù)篩后獲得2株編號(hào)為T(mén)LLU-1501、TLLU-1502的優(yōu)良菌株，其發(fā)酵效價(jià)分別為13162、12236 μg/mL。采用EMS+UV復(fù)合誘變，得到34株正突變株，復(fù)篩后獲得3株編號(hào)為T(mén)LEU-1501、TLEU-1502、TLEU-1503的優(yōu)良菌株，其發(fā)酵效價(jià)分別為13427、l3873、14124 μg/mL。

表1 不同誘變方法誘變影響的比較

同一誘變方法中同列數(shù)據(jù)上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同誘變方法所選優(yōu)良菌株遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 對(duì)不同誘變方法獲得優(yōu)良菌種進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)篩，

測(cè)定其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株TLU-1502、TLLU-1502、TLEU-1503遺傳穩(wěn)定性好(表2)。

表2 優(yōu)良菌種遺傳穩(wěn)定性分析

2.3 優(yōu)良菌株泰樂(lè)菌素抗性檢測(cè) 將菌株TLU-1502、TLLU-1502、TLEU-1503的菌株孢子懸液稀釋為1×10-4，然后分別涂布于含有15000 μg/mL泰樂(lè)菌素的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后，觀(guān)察菌落的生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLU-1502和TLEU-1503菌株的生長(zhǎng)情況好，而TLLU-1502生長(zhǎng)情況一般(表3)。結(jié)果表明，TLLU-1502、TLEU-1503具有較好的泰樂(lè)菌素抗性。

表3 泰樂(lè)菌素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

+++表示菌落生長(zhǎng)好，++表示菌落生長(zhǎng)一般。

2.4 優(yōu)良菌株豆油抗性檢測(cè) 將菌株TLU-1502、TLLU-1502、TLEU-1503的菌株孢子懸液稀釋為1×10-4，然后分別涂布于含有4.0%豆油的平板上，以不含豆油的平板為對(duì)照。培養(yǎng)后，觀(guān)察菌落的生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含豆油的培養(yǎng)基上三株菌種的菌落比不含豆油的培養(yǎng)基上的菌落明顯大，且未見(jiàn)孢子(表4)。結(jié)果表明，這3個(gè)菌株均具有較好的豆油抗性。

表4 豆油對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.5 優(yōu)良菌株發(fā)酵組分的分析 將菌株選育出的優(yōu)良菌株TLLU-1502、TLEU-1503以及原始菌株TL-15028進(jìn)行搖瓶發(fā)酵(培養(yǎng)液中豆油含量40 g/L)，發(fā)酵后，分別測(cè)定它們生產(chǎn)泰樂(lè)菌素4種主要組分的效價(jià)以及發(fā)酵液中的殘油量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLEU-1503菌種生產(chǎn)的泰樂(lè)菌素中A組分明顯高于對(duì)照，而C組分低于對(duì)照(表5)。TLEU-1503發(fā)酵液中的殘油量最低，說(shuō)明TLEU-1503對(duì)豆油的利用效率最高(表6)。

表5 發(fā)酵液中泰樂(lè)菌素組分的比較

表6 發(fā)酵液中殘油量的比較

3 討 論

采用UV和EMS單一誘變，處理時(shí)間是關(guān)鍵，時(shí)間過(guò)短(處理時(shí)間30 s)，誘變的正突變率較低，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(處理時(shí)間90 s)，致死率過(guò)高，均不利于后期的篩選。因此，在綜合考慮致死率、正突變率、突變菌株效價(jià)的前提下，以60 s作為UV適宜的誘變處理時(shí)間。同樣，在EMS誘變處理時(shí)，也是綜合考慮上述指標(biāo)后，以4 h作為適宜的誘變處理時(shí)間。UV誘變的機(jī)理是使菌體內(nèi)同鏈DNA形成胸腺嘧啶二聚體，阻止堿基正常配對(duì)，進(jìn)而引起突變，但UV突變易產(chǎn)生光修復(fù)。EMS是一種化學(xué)誘變劑，可使菌體內(nèi)DNA的鳥(niǎo)嘌呤烷基化，導(dǎo)致堿基錯(cuò)配，進(jìn)而引起突變。采用UV和EMS單一誘變，對(duì)弗氏鏈霉菌誘變效果可能有限，往往不及復(fù)合誘變[2]。相比單一誘變而言，復(fù)合誘變產(chǎn)生的突變更多，正突變率更高，其對(duì)應(yīng)的表型可能更豐富，更容易選育出符合預(yù)期的優(yōu)良菌株。本文所采用的LiCl+UV、EMS+UV兩種復(fù)合誘變方法，其誘變效果較單一誘變更佳，其中，EMS+UV誘變效果最佳，這與徐紅梅等[9]的結(jié)論一致。同時(shí)，本文對(duì)誘變得到優(yōu)良菌株進(jìn)行了泰樂(lè)菌素抗性、豆油抗性的定向篩選，使其更符合實(shí)際生產(chǎn)的要求。

相對(duì)出發(fā)菌株而言，TLEU-1503的發(fā)酵組分中泰樂(lè)菌素A含量明顯提升，C含量有較大幅度的下降，有利于泰樂(lè)菌素品質(zhì)的提升，這與甘士喜等的研究結(jié)論相符[11]。同時(shí)，TLEU-1503還具有較好的泰樂(lè)菌素抗性和豆油抗性，這樣既可以避免發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中不斷積累的泰樂(lè)菌素的反饋抑制作用；還可以充分利用發(fā)酵液中的豆油，有助于提高生產(chǎn)效率。TLEU-1503發(fā)酵組分中泰樂(lè)菌素A含量明顯提升，C含量大幅下降，這一現(xiàn)象可能是由兩方面的因素造成的，首先可能是由于TLEU-1503生產(chǎn)泰樂(lè)菌素的效率增加了，其次可能是由于催化組分C向組分A轉(zhuǎn)化的大菌素C甲基轉(zhuǎn)移酶活性提高了[9,11]。弗氏鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中常以豆油作為碳源，豆油在被利用時(shí)，菌體必須具備較高活性的脂肪酶，TLEU-1503具有較高的豆油利用效率，這表明其菌體的脂肪酶活性較高[12]。有關(guān)TLEU-1503菌株大菌素C甲基轉(zhuǎn)移酶活性和脂肪酶活性變化還有待于進(jìn)一步深入研究。

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(編輯：陳希)

The Effect of Different Induction Mutation Method on Production Performance for Tylosin in TL-15028 Strain

LI Chun-ling, DING Ya-lian, XIE Wen-jing, NIU Chun, ZHANG Ping*

(NingxiaTairuiPharmaceuticalCompanyLimited,Yinchuan750101,China)

In order to screening of high yield strain for tylosin, TL-15028 strain was selected as original strain. The original strain was mutation treated with chemical mutation, physical mutation and compound mutation, respectively. The mutagenic effect of the three methods were compared. The TLEU-1503 strain, which with high inheritance stability and resistance to tylosin and soybean oil, was screened. The potency of TLEU-1503 strain, which was 14124 μg/mL, had improved 36.5% than original strain. The result had great significance for efficient production and quality improvement of tylosin.

tylosin; high yield strain; compound mutation; screening

李春玲，主要從事微生物發(fā)酵菌種選育研究。

2016-07-28

A

1002-1280 (2016) 12-0029-05

S852.6