侯美如，劉宇，王巖，尹珺伊，周慶民，秦平偉，史同瑞，楊淑萍

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所 黑龍江齊齊哈爾 161006)

不同提取工藝對(duì)黃芪總皂苷提取效果的研究

侯美如，劉宇，王巖，尹珺伊，周慶民，秦平偉，史同瑞*，楊淑萍

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所 黑龍江齊齊哈爾 161006)

為了研究黃芪經(jīng)發(fā)酵后對(duì)黃芪總皂苷釋放量的影響。采用水浸法、水煎法提取黃芪與發(fā)酵黃芪中總皂苷，利用紫外分光光度法測(cè)定黃芪總皂苷的提取量。結(jié)果顯示，發(fā)酵黃芪經(jīng)水浸法、水煎法提取的總皂苷量分別為6.568、4.843 mg/g，顯著高于對(duì)照黃芪的提取量5.356、4.007 mg/g。黃芪經(jīng)產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵后，可有效提高黃芪總皂苷的釋放量，長(zhǎng)時(shí)間水煎會(huì)致皂苷受損，致使含量降低。

發(fā)酵中藥；黃芪甲苷；釋放量

黃芪總皂苷是中藥黃芪中的重要生理活性成分，因此黃芪總皂苷常作為黃芪藥材的定性定量指標(biāo)[1]。中草藥有效成分的釋放量直接影響著其藥效的發(fā)揮。根據(jù)中草藥種類(lèi)及其有效活性成分性質(zhì)的不同，應(yīng)選擇較為適宜的提取工藝，以提升有效成分的提取率，提高中藥療效。中藥提取有著久遠(yuǎn)的歷史，冷浸漬法、回流法、煎煮法、索氏提取法等都是傳統(tǒng)的提取分離手段[2]。然而這些提取工藝往往存在提取時(shí)間長(zhǎng)，溶劑消耗大、提取效率低下、雜質(zhì)含量大、操作流程復(fù)雜等缺點(diǎn)。隨著中藥發(fā)酵技術(shù)的不斷開(kāi)展，大量學(xué)者運(yùn)用發(fā)酵技術(shù)以實(shí)現(xiàn)中藥有效成分的釋放，這不僅能提高中藥有效成分的釋放量，而且還可通過(guò)微生物對(duì)中藥的纖維、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等成分的利用和轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生包含多種活性成分的制劑或新藥[3]。

研究證實(shí)，黃芪中黃芪總皂苷是心臟正性肌力作用的主要有效成分，也是降壓的有效成分之一[4]。目前，黃芪皂苷提取方法常采用超聲波提取法、索氏提取器提取法、發(fā)酵法、酶解法、浸泡提取法和大孔樹(shù)脂吸附法[1,5]。研究利用分離篩選的產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢桿菌對(duì)中藥黃芪進(jìn)行了發(fā)酵，為檢驗(yàn)生物發(fā)酵對(duì)中藥活性成分釋放量的影響，以黃芪總皂苷為考察指標(biāo)，比較了生物發(fā)酵法與普通傳統(tǒng)提取方法對(duì)黃芪皂苷的提取效果，旨在為黃芪活性成分提取提供更為簡(jiǎn)單、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 黃芪，河北凱達(dá)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：20151213)，上海金穗生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：黃芪粉(過(guò)40目篩)30 g、黃豆粉10 g、CaCO30.2 g、水59.8 mL。解淀粉芽孢桿菌SSYB菌株，由本研究室分離鑒定并保存。

1.2 儀器設(shè)備 UV-1900PC雙束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；分析天平，常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；振蕩器,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 總皂苷提取方法

1.3.1 發(fā)酵水浸法 取解淀粉芽孢桿菌SSYB菌株普通肉湯培養(yǎng)種子液，按2%接種量接種黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，置37 ℃環(huán)境培養(yǎng)72 h。取發(fā)酵黃芪樣品100 g，加入超純水500 mL，混勻，置振蕩器中振蕩浸泡60 min，以4000 r/min離心10 min，取上清液，置于500 mL容量瓶中定容。

1.3.2 水浸法 取含2%普通肉湯的黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，置37 ℃環(huán)境放置70～72 h，然后取未經(jīng)發(fā)酵的黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基100 g，加入超純水500 mL，混勻，置振蕩器中振蕩浸泡60 min，以4000 r/min離心10 min，取上清液，置于500 mL容量瓶中定容。

1.3.3 發(fā)酵水煎法 取按1.3.1發(fā)酵法發(fā)酵的黃芪樣品100 g，加入超純水500 mL，混勻，浸泡30 min，以武火煮沸后，再以文火煮1 h，邊水煎邊補(bǔ)水。水煎黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)4000 r/min離心10 min，取上清液，置于500 mL容量瓶中定容。

1.3.4 水煎法 取含2%普通肉湯的黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，置37 ℃環(huán)境放置70～72 h，然后取未經(jīng)發(fā)酵的黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基100 g，加入超純水500 mL，混勻，浸泡30 min，以武火煮沸后，再以文火煮1 h，邊水煎邊補(bǔ)水。水煎黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)4000 r/min離心10 min，取上清液，置于500 mL容量瓶中定容。

1.4 樣品中黃芪總皂苷的提取 參照文獻(xiàn)方法[6]，取1.3所述四種方法的提取液各50 mL，分別置于分液漏斗中，加入正丁醇50 mL，進(jìn)行萃取。棄液再次用正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，加入1% NaOH溶液100 mL，洗滌3次，除色素后用超純水洗至中性，收集正丁醇溶液，置70 ℃水浴揮干溶劑，加甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，備用。

1.5 黃芪總皂苷的測(cè)定

1.5.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品15.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容，混勻，即得黃芪甲苷對(duì)照品溶液。

1.5.2 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 準(zhǔn)確吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mL于試管中，置70 ℃水浴中揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴作用15 min，取出放冰水浴中，冷卻，加入冰醋酸5 mL，搖勻，以試劑作空白對(duì)照，在篩選確定的測(cè)定波長(zhǎng)543 nm處測(cè)定黃芪甲苷吸光度值。用甲苷質(zhì)量濃度(C)作橫坐標(biāo)，以吸光度值(A)作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5.3 樣品溶液及其顯色后的穩(wěn)定性試驗(yàn) 取發(fā)酵法黃芪皂苷提取液，置室溫分別放置0、1、2、3、4 h，取提取液25 μL，按1.4.2方法進(jìn)行顯色后測(cè)定吸光度值。另取黃芪皂苷提取液25 μL，依法進(jìn)行顯色，在室溫分別放置0、1、2、3、4 h，測(cè)定吸光度值，計(jì)算樣品中每克黃芪的總皂苷含量。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批發(fā)酵法黃芪皂苷提取液樣品6份，按1.5.2方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算樣品中每克黃芪的總皂苷含量。

1.5.5 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知甲苷含量的發(fā)酵黃芪皂苷提取液樣品6份，加入一定量的甲苷對(duì)照品溶液，按1.5.2方法顯色后測(cè)定吸光度值，計(jì)算樣品中的皂苷含量，并計(jì)算回收率。1.5.6 總皂苷提取量的測(cè)定 取樣品提取液25 μL，分別放入干燥試管中，水浴揮干溶劑，按1.5.2方法顯色，在543 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及計(jì)算公式，得黃芪總皂苷提取量。

計(jì)算公式：X=(C×V0×V1×N)/(M×V2×1000)

式中：X為樣品中每克黃芪總皂苷含量(mg/g);V0為經(jīng)萃取后的樣品總皂苷提取液(mL)；V1為顯色反應(yīng)體系體積(mL)；V2為測(cè)定吸取體積(mL)；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出的待測(cè)液中總皂苷濃度(μg/mL)；M為樣品中黃芪質(zhì)量(g)；N為樣品提取液與待萃取樣品提取液的體積比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SAS (SAS forw indows, Version 8.2)軟件包中的stat模塊中的平衡試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的Anova過(guò)程，多重比較用Duncan法進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 以543 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg/mL溶液的吸光度值，結(jié)果分別為0.043、0.069、0.091、0.116、0.139、0.165?；貧w方程為：A=0.0241C+0.0193R2=0.9996。試驗(yàn)表明，在1.0～6.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，吸光度值與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 樣品溶液及其顯色后溶液的穩(wěn)定性 樣品溶液及其顯色后穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，其RSD分別為0.0693%和0.1473%，結(jié)果表明，樣品溶液及其顯色后溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定，見(jiàn)表1。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，黃芪總皂苷平均含量為6.561±0.0045 mg/g，RSD為0.0678%，方法重復(fù)性良好。

2.4 回收率試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，其平均回收率為100.12±0.26%，RSD為0.2543%，結(jié)果表明，本法具有良好的回收率。2.5 不同工藝對(duì)黃芪總皂苷的提取效果 由表4可知，發(fā)酵水浸法黃芪總皂苷提取量最高，達(dá)到6.568±0.0068 mg/g，其次為水浸法，為5.356±0.0061 mg/g，水煎法最低，為4.007±0.0123 mg/g。發(fā)酵水浸法較水浸法的總皂苷的提取量提高了22.63%，水煎法組較水浸法組質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了33.67%，發(fā)酵水煎組較水煎法組總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所增加，但仍低于水浸法組。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表3 回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表4 不同工藝對(duì)黃芪甲苷的提取效果(n=3)

同一列中上標(biāo)字母完全相同者差異不顯著(P>0.05)，完全不同者差異極顯著(P<0.05)，有相同字母者差異顯著。

3 討 論

目前，常用的定量測(cè)定黃芪中黃芪總皂苷的方法有薄層掃描法、高效液相色譜法、薄層色譜-分光光度法、比色法、紫外分光光度法等測(cè)定方法[7]。紫外分光光度法不僅能測(cè)定有色物質(zhì)，還能精確測(cè)定有共軛結(jié)構(gòu)的無(wú)色物質(zhì)，屬于經(jīng)典、成熟的方法。因其簡(jiǎn)便、靈敏、適應(yīng)面廣、常用于皂苷的分析[8]。因此本試驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定總皂苷含量。

試驗(yàn)結(jié)果表明，水煎法黃芪總皂苷的提取量均低于相應(yīng)的水浸法，說(shuō)明皂苷的熱穩(wěn)定性可能較差，長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理會(huì)使皂苷受損而致含量下降，這與一些學(xué)者研究結(jié)果一致。黃芪甲苷在藥材中主要是以其結(jié)構(gòu)中C-3位木糖基上不同位置羥基的乙?；锏男问酱嬖?，研究中發(fā)現(xiàn)，因黃芪甲苷乙?；锏幕瘜W(xué)不穩(wěn)定性，在制劑生產(chǎn)工藝過(guò)程中黃芪甲苷含量受不同處理?xiàng)l件影響較大[9]。郁帥陸等[10]研究證實(shí)，黃芪經(jīng)高溫處理后，其皂苷含量降低了63.2%，推測(cè)是在高溫處理的過(guò)程中，可能使極性皂苷中連接苷元和多糖的糖苷鍵部分?jǐn)嗔焉煞菢O性的皂苷元，從而不能經(jīng)極性較大的甲醇提取出來(lái)，同樣本試驗(yàn)也采用了醇類(lèi)作為萃取劑對(duì)黃芪皂苷進(jìn)行萃取，因此導(dǎo)致皂苷提取量較低。

有關(guān)黃芪總皂苷熱穩(wěn)定性的研究報(bào)道較少，但對(duì)人參總皂苷熱穩(wěn)定性的研究相對(duì)較多。余瀟苓等[11]研究證實(shí)，對(duì)紅參須中的5種皂苷高溫處理后，其皂苷含量均有所下降，5種皂苷發(fā)生了不同程度的降解反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)皂苷糖基的不同結(jié)構(gòu)決定了降解速率的差異。林龍飛等[12]對(duì)人參莖葉水提液中的2種皂苷的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)2種皂苷均發(fā)生了不同程度的降解，并隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)和溫度的升高，其降解速率也隨之加快，在100 ℃、80 ℃和60 ℃條件下加熱12 h，皂苷分別降至初始含量的20%、60%及80%，推測(cè)是加熱條件下發(fā)生水解、脫掉糖基，生成皂苷元，使2種皂苷含量下降。由于黃芪總皂苷與人參總皂苷的組成成分及比例存在一定差異，高溫引起總皂苷含量下降的原因也可能存在差異。高溫處理引起黃芪皂苷含量降低是由于皂苷極性轉(zhuǎn)變影響了測(cè)定結(jié)果，還是由于皂苷發(fā)生了降解或轉(zhuǎn)化成其它物質(zhì)，尚需進(jìn)一步研究加以解釋。

試驗(yàn)采用水浸法和水煎法兩種工藝，比較了發(fā)酵黃芪對(duì)活性成分總皂苷釋放的影響，結(jié)果表明，不論是水浸法，還是水煎法，發(fā)酵黃芪總皂苷的提取量均顯著高于非發(fā)酵黃芪。這說(shuō)明黃芪經(jīng)過(guò)產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵菌產(chǎn)生的纖維素酶降解了中草藥細(xì)胞壁的組成成分纖維素、木質(zhì)素等，使包裹在細(xì)胞壁內(nèi)活性成分得以釋放，因此，應(yīng)用產(chǎn)纖維素酶微生物發(fā)酵中藥有利于活性成分的釋放[13]。中藥發(fā)酵無(wú)需化學(xué)提取劑，工藝簡(jiǎn)單，成本低，且本試驗(yàn)采用解淀粉芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，安全性好，一些學(xué)者[14-16]將其作為益生菌添加劑添加到飼料，以提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，因此，發(fā)酵法在提高中藥有效成分釋放的同時(shí)，還可補(bǔ)充益生菌，兩者協(xié)同作用，增強(qiáng)動(dòng)物抗病力，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。

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(編輯：陳希)

Effect of Different Extraction Processes on the Content of the Total Saponins of Astragalus

HOU Mei-ru，LIU Yu，WANG Yan，YIN Jun-yi，ZHOU Qin-min，QIN Ping-wei，SHI Tong-rui*，YANG Shu-ping

(HeilongjiangInstituteofVeterinaryMedicineScience，Qiqihaer，Heilongjiang161006，China)

In the present, the influence of fermented extraction of the total saponins in astragalus was investigated. Water immersion method and water decoction method were used to extract the total saponins in astragalus and fermented astragalus. The extracted content of total saponins in astragalus were detection using UV spectrophotometry. The content of total saponins in fermented astragalus extracted utilizing water immersion method and water decoction method were 6.568 and 4.843 mg/g, respectively, the result was significantly higher than the control group, which the content of total saponins were 5.356 and 4.007 mg/g, respectively. This results indicated that the release content of the total saponins in astragalus could be efficiently improved after the astragalus was fermented by cellulase-producingBacillusamyloliquefaciens, and long-time decoction will caused damage to saponins and resulted in reducing of the content of total saponins.

fermentation of traditional Chinese medicine； total saponins；release amount

黑龍江科技計(jì)劃項(xiàng)目：生物發(fā)酵中藥制劑的研究與開(kāi)發(fā)(GC13B404)

2016-07-15

A

1002-1280 (2016) 12-0024-05

S853.7