張航俊，周芷錦，侯軒，朱聰英，周煒，陳慧華

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311100)

HPLC-MS/MS檢測(cè)雙黃連注射液中非法添加13種喹諾酮類藥物的研究

張航俊，周芷錦，侯軒，朱聰英，周煒，陳慧華*

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311100)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)獸用中藥制劑雙黃連注射液中非法添加13種喹諾酮類藥物的方法。樣品經(jīng)0.2%甲酸溶液溶解后稀釋，以0.2%甲酸溶液與甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定。13種喹諾酮類藥物檢測(cè)限(LOD)為0.1～0.5 mg/mL，定量限(LOQ)為1～5 mg/mL，在5.0～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99,在5、10、20 mg/mL 三個(gè)添加濃度下，平均回收率為90.9%～101.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～3.8%。

中獸藥制劑；喹諾酮類藥物；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

喹諾酮類(4-quinolones)，又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥，目前常用的是第三代的恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等。這類藥物對(duì)多種革蘭氏陰性菌有殺菌作用，廣泛用于泌尿生殖系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及呼吸道、皮膚組織的革蘭陰性細(xì)菌感染的治療。因其廣泛的抗菌范圍、良好的治療作用，經(jīng)常被添加到一些獸用中藥制劑當(dāng)中以增強(qiáng)療效。非法添加會(huì)令養(yǎng)殖戶在不知情的情況下使用抗生素，不但誘發(fā)耐藥性，而且還導(dǎo)致藥物殘留，對(duì)人體健康具有潛在的危害。例如環(huán)丙沙星會(huì)誘發(fā)過敏性反應(yīng)如皮疹、皮膚瘙癢，氧氟沙星會(huì)引起肝臟損傷等。喹諾酮類藥物作為一類廣泛使用的抗生素，被濫用和非法添加的可能性較大，但是目前沒有針對(duì)獸藥中喹諾酮類藥物非法添加的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，也沒有中獸藥注射劑中非法添加喹諾酮類藥物的液質(zhì)檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道，本文對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 Agilent 1290N 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；AB 5500 Q-Trap質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)，配電噴霧離子源(ESI)；電子天平(瑞士Mettler，精度十萬(wàn)分之一)。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 試劑 甲酸、甲醇(色譜純，默克公司)；氫氧化鈉(分析純，屹達(dá)化工)；水為超純水。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品 洛美沙星(Lomefloxacin,LOM)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、諾氟沙星(Norfloxacin,NOR)、伊諾沙星(Enoxacin,ENO)四種標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)、噁喹酸(oxolinicacid,OXO)、雙氟沙星(Difloxacin,OIF)、恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)、氟甲喹(Flumequine,FLU) 五種標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；麻保沙星(Marbofloxacin,MAR)、沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)、達(dá)氟沙星(Danofloxain,DAN)、培氟沙星(pefloxacin,PEF) 四種標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液(100 μg/mL) 精密稱定相當(dāng)于各藥物10 mg的喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，分別于100 mL容量瓶中，用0.03 mol/L 氫氧化鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。-20 ℃以下保存。

1.2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 μg/mL) 分別精密量取喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)貯備液各1.00 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成1 μg/ mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20 ℃以下保存。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液 精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.2.2.2項(xiàng))50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、2 mL分別置于10 mL容量瓶中，用0.2%甲酸溶液稀釋定容至刻度，得到濃度5、10、20、50、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)溶液 精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品100 mg置于10 mL容量瓶中，用0.03 mol/L 氫氧化鈉溶液溶解并稀釋定容至刻度，制成濃度為10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)溶液,同法配置20、40 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)溶液。

1.3 供試品

1.3.1 陰性對(duì)照注射液 雙黃連注射液，浙江匯特動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150712。1.3.2 陽(yáng)性添加注射液 精密量取5 mL 10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)溶液，置于10 mL容量瓶中，用陰性對(duì)照注射液定容至刻度，混勻，即得5 mg/mL的陽(yáng)性添加注射液，取20、40 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)溶液,同法配置10、20 mg/mL的陽(yáng)性添加注射液。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 樣品處理 精密量取中獸藥注射劑1 mL，置100 mL 容量瓶中，用0.2%甲酸溶液溶解，超聲5 min，靜置放冷至室溫，用0.2%甲酸溶液定容至刻度，作為提取液；取提取液0.1 mL用0.2%甲酸溶液稀釋至10 mL，作為稀釋液；取稀釋液0.1 mL用0.2%甲酸溶液稀釋至10 mL,作為上機(jī)液；取上機(jī)液，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.4.2 色譜條件 Waters Atlantis C18 柱(3.0 mm×150 mm, 3.0 μm);進(jìn)樣量10 μL; 柱溫30 ℃，流動(dòng)相組成及流速見表1。

表1 流動(dòng)相組成和流速

1.4.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源電壓：5500 V；輔助加熱氣溫度：500 ℃；氣簾氣流速(Curtain Gas)：40 L/h；脫溶劑流速：中等(Medium)；離子源氣流速：霧化氣(Gas 1)和輔助氣(Gas 2)均為45 L/h；駐留時(shí)間(dwell time)：20 ms；13種喹諾酮類藥物的定性、定量離子對(duì)及去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 喹諾酮類藥物多反應(yīng)檢測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜條件

*：定量離子

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液按1.4.2、1.4.3項(xiàng)所述條件進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程與檢出限、定量限 分別以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，以工作液濃度(ng/mL)橫坐標(biāo)，13種藥物的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，在5.0～200 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。采用空白樣品添加方法，按1.4項(xiàng)進(jìn)行處理和檢測(cè)，得到本方法13種待測(cè)藥物檢出限為(LOD)0.1～0.5 mg/mL，定量限(LOQ)為1～5 mg/mL。13種喹諾酮類藥物的線性方程和定量限見表3，陰性對(duì)照及陰性對(duì)照定量限添加濃度MRM譜圖見圖1、圖2。

表3 13種喹諾酮類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

圖1 陰性對(duì)照注射液圖譜

圖2 陰性對(duì)照注射液喹諾酮類藥物定量限添加濃度譜圖

2.2 回收率試驗(yàn) 取陰性對(duì)照注射液，添加三個(gè)不同濃度(5、10、20 mg/mL)喹諾酮類藥物，按1.4.1項(xiàng)進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加濃度做5個(gè)平行，求得其平均回收率與批內(nèi)變異系數(shù)。重復(fù)三次試驗(yàn)，求得批間變異系數(shù)如表4所示，雙黃連注射液中13種喹諾酮類藥物在其添加濃度為5 mg/mL、10 mg/mL和20 mg/mL三個(gè)水平下的平均回收率為90.9%～101.9%，批間變異系數(shù)為0.6%～3.8%。

表4 雙黃連注射劑中13種喹諾酮類藥物的回收率

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測(cè)方法的選擇 高效液相色譜法，特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，但是測(cè)定種類少，檢測(cè)限很難降低[1]，中獸藥制劑基質(zhì)復(fù)雜，對(duì)液相分離效果要求高。本文采取的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高、測(cè)定種類多，在本文色譜條件下，25 min便能完成樣品中13種喹諾酮藥物的檢測(cè)，干擾小、速度快、效率高。

3.2 樣品處理方法的選擇 中藥注射劑與肉、蛋、奶、血漿等樣品相比，沒有蛋白和脂肪的干擾，且注射劑中藥物添加量大，無需通過固相萃取柱進(jìn)行凈化和濃縮，直接稀釋就可以起到去除干擾的作用[2-6]。按本文方法處理，簡(jiǎn)單、快捷，基質(zhì)干擾小。應(yīng)用本文方法抽檢了板藍(lán)根注射液、雙黃連注射液、柴胡注射液、黃芪多糖注射液、魚腥草注射液、穿心蓮注射液7類共47批次的中獸藥注射液，其中7批次檢出喹諾酮類藥物的非法添加，40批次陰性樣品在喹諾酮類藥物相應(yīng)保留時(shí)間處均無干擾。結(jié)果表明目前在畜禽中獸藥注射液中添加喹諾酮類抗菌藥物以提高治療效果的現(xiàn)象確實(shí)存在。

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)中獸藥注射劑中非法添加13種喹諾酮類藥物的方法。結(jié)果表明，該方法樣品處理簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，對(duì)于其他中獸藥制劑中檢測(cè)喹諾酮類藥物的非法添加具有借鑒意義。

[1] 農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1025-14-2008號(hào)[S]．

[2] 溫中明，李東，徐玉紅.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人血漿中多種喹諾酮類藥物濃度[J].中國(guó)藥業(yè)，2011,20(14)：25-27．

[3] GB/T 21312-2007．動(dòng)物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]．

[4] 李佩佩，郭遠(yuǎn)明，陳雪昌，等.色譜法檢測(cè)動(dòng)物源食品中喹諾酮類藥物殘留研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2013,(3):303～307．

[5] 中國(guó)獸藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸藥典二○一○年版(一部)[S]．

[6] 農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2508 號(hào)[S]．

(編輯：侯向輝)

Determination of Illegally Added 13 Quinolones in Shuanghuanglian Injection by HPLC-MS/MS

ZHANG Hang-jun,ZHOU Zhi-jin, HOU Xuan，ZHU Cong-ying, ZHOU Wei，CHENG Hui-hua*

(ZhejiangProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff，Hangzhou311100，China)

A method of HPLC-MS/MS was developed to determine 13 quinolones illegally added in traditional Chinese medicine for animal. The sample was dissolved and diluted with 0.2% formic，then separated with HPLC which was using gradient elution with methanol and 0.2% formic acid. Qualitative and quantitative analysis of the 13 quinolones were carried out in multiple reactions monitoring mode (MRM)．The limits of detection (LODs) of 13 quinolones were in the range of 0.1～0.5 ng/mL，the limits of quantitation (LOQs) of 13 quinolones were in the range of 1～5 mg/mL. The correlation coefficient of 13 quinolones in the range from 5.0 to 200 ng/mL was greater than 0.99. The results showed that when the concentrations of 13 quinolones were between 5 and 20 mg/mL, the average recoveries ranged from 90.9% to 101.9%, with relative standard deviations of 0.6% - 3.8%.

traditional Chinese medicine for animal; quinolones;HPLC-MS/MS

張航俊，本科，從事獸藥、畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)研究。

2016-06-27

A

1002-1280 (2016) 12-0059-06

S859.83