孫利杰,劉東旭，李健明，時坤，冷雪，李東，杜銳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學研究生院，長春 130118)

ADV分離強毒株全基因突變重組質(zhì)粒的構建、表達及其免疫原性的分析

孫利杰1,劉東旭1，李健明1，時坤1，冷雪1，李東1，杜銳2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學研究生院，長春 130118)

為研制水貂阿留申病核酸疫苗, 應用重疊延伸PCR技術去除ADV VP2基因中編碼428～446位氨基酸的核苷酸序列，與pcDNA3.1(+)載體連接，構建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428，在此基礎上，截去編碼487～501位氨基酸的核苷酸序列，構建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428-487。將構建的重組質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射免疫小鼠, 應用間接 ELISA法檢測接種后14、28、42、56 d抗ADV抗體水平;流式細胞術檢測接種后第42天小鼠脾細胞CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群。結果顯示，小鼠接種質(zhì)粒后CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群數(shù)量均明顯增加,第42天抗ADV抗體水平達峰值。本試驗通過對ADV全基因突變重組質(zhì)粒的免疫原性進行分析，為水貂阿留申病核酸疫苗的研制提供了參考。

水貂阿留申病毒；真核表達載體；反應原性；免疫原性

水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AD)是制約水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要疾病[1]，具有阿留申基因型的水貂甚至有1/3死于該病[2]。水貂感染水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)后，病毒可在體內(nèi)持續(xù)感染引發(fā)強烈的體液免疫，出現(xiàn)高水平的特異性抗體以及自身抗體，但抗體不能中和這些病毒，反而會形成抗原抗體復合物[3-5]，引發(fā)抗體依賴性增強(Antibody dependent enhancement, ADE)，即特異性抗體的存在可增強病毒的感染，這也是ADV致宿主免疫功能紊亂及絕大多數(shù)AD疫苗免疫失敗的主要原因之一?？乖贵w復合物在貂體內(nèi)不能被清除，隨血液循環(huán)流動，最終在腎小球及其他器官動脈管壁的基底膜形成沉淀，損傷腎小球及其他組織，表現(xiàn)為腎小球腎炎和動脈血管炎等[6-8]。因該病致病機理特殊，研制開發(fā)針對ADV的疫苗，一直是動物醫(yī)學界很棘手的問題[9]。

目前開展的水貂阿留申病疫苗研究主要包括滅活苗、VP2亞單位疫苗及針對NS1的核酸疫苗，而這些疫苗對水貂阿留申病毒感染不具有或僅具有部分保護作用。DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，具有很多優(yōu)勢，針對水貂阿留申病的DNA疫苗的研究也越來越多，但目前還沒有能有效防控水貂阿留申病的DNA疫苗。本實驗通過對ADV分離強毒株全基因組中與抗原抗體復合物形成有關的片段和介導ADE反應的相關片段進行切除、重組，構建重組質(zhì)粒，通過對重組質(zhì)粒的反應原性和免疫原性的檢測，以期為后續(xù)試驗和針對水貂阿留申病核酸疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 病毒、載體和細胞 水貂阿留申病病毒強毒株由吉林農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟動物疫病實驗室分離及保存；pcDNA3.1/V5HisA真核表達載體購于invitrogen公司；L929細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 主要試劑 脂質(zhì)體轉染試劑盒FuGENE?HD購自Promega公司；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶KPnI和NotI、T4DNA連接酶，均購自TaTaRa生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，均為杭州維特潔生化技術有限公司產(chǎn)品；FITC標簽的兔抗水貂抗體及HRP標記的兔抗水貂抗體購自北京博奧森公司；細胞因子檢測試劑盒購自BiLegend公司。

2 方法

2.1 引物的設計與合成 利用DNA-star軟件，根據(jù)本實驗室所分離保存的ADV強毒株全基因序列，應用重疊延伸PCR原理設計引物，對應去除vp2區(qū)域中主要抗原表位及抗原抗體復合物結合位點428～446位氨基酸，同時去除潛在的抗原抗體復合物結合位點487～501位氨基酸。應用Primer5.0設計3對引物，并在全長引物中添加KPnI和NotI酶切位點(下劃線部分)。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。

2.2 突變?nèi)蛘婧酥亟M質(zhì)粒的構建及鑒定

2.2.1 切除428～446位氨基酸全基因真核重組質(zhì)粒的構建 以總上和428為上下游引物，實驗室所保存的ADV分離強毒株DNA為模板，PCR擴增大小約為3600 bp的目的片段。PCR擴增程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 1 min，63.5 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，35循環(huán)，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r以446和總下為上下游引物，擴增大小約為870 bp目的片段。PCR擴增程序如下:95 ℃預變性5 min，95 ℃ 1 min，62.7 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，35循環(huán)，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 各段上下游引物

以兩段PCR產(chǎn)物為模板，總上和總下為引物，進行重疊延伸PCR，將兩段PCR產(chǎn)物進行融合。PCR程序如下：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，68.3 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，30循環(huán)，72 ℃ 7 min 4 ℃保存?zhèn)溆?。將融合產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)載體，同時用KPnI和NotI酶進行雙酶切，在T4DNA酶的作用下進行連接，構建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428。將連接產(chǎn)物轉化到JM109感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選。挑取白色菌落，經(jīng)鑒定后的重組質(zhì)粒送至上海生物工程股份有限公司進行測序。

2.2.2 切除428～446位和487～501位氨基酸全基因重組質(zhì)粒的構建 以總上和487為上下游引物，全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428為模板，擴增大小約為3750 bp片段，擴增程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 1 min，62.7 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，35循環(huán)，72 ℃ 7 min 。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以501和總下為上下游引物，pcDNA3.1-ADV-428重組全基因為模板，擴增大小約為700 bp片段，擴增程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 1 min，60.7 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，35循環(huán)，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將以上兩段PCR產(chǎn)物進行融合，同方法2.2.1項，構建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428-487。

2.3 重組質(zhì)粒轉染L929細胞表達產(chǎn)物的免疫熒光檢測 將L929細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中, 在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)過夜, 待細胞密度達到80%～90%時,按照FuGENE?HD 轉染試劑盒說明書進行操作：將純度OD260/280達到1.7～1.9的2種重組質(zhì)粒分別和轉染試劑以1∶2的比例混合轉染L929細胞, 在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng),同時設空質(zhì)粒對照組和空白細胞對照組。用常規(guī)間接免疫熒光法檢測表達產(chǎn)物：轉染48 h后，取出細胞培養(yǎng)板，PBS洗滌后用冷乙醇于-20 ℃固定30 min；5%血清封閉2 h；漂洗后加入阿留申陽性血清(150倍稀釋)37 ℃作用1 h；PBS洗滌3次；以FITC標記的兔抗水貂抗體為二抗(1000倍稀釋)37 ℃作用1 h。置于熒光顯微鏡下觀察[10-11]。

2.4 動物免疫實驗 選取健康小鼠隨機分為5組。A：pcDNA3.1-ADV-428組；B：pcDNA3.1-ADV-428-487組；C: 滅活疫苗組；D：空載體組；E: PBS空白組。分別在第0、14和28天肌肉注射免疫，A、B、D組質(zhì)粒接種劑量為100 μg/只;E組接種PBS 100 μL/只;C組接種滅活病毒100TCID50/只。首次接種后，分別在第14、28、42和56天進行采血，分離血清備用。

2.5 免疫小鼠脾臟T淋巴細胞亞群測定 在第42天取各組小鼠脾臟進行研磨，取研磨液處理后進行細胞計數(shù)。用1640營養(yǎng)液(加10%小牛血清)調(diào)整細胞濃度至5×108個/L，加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，每個樣品設六個重復，其中兩孔加100 μL ADV全病毒抗原，兩個孔加conA，最后兩個孔加細胞培養(yǎng)液作為空白對照，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL CCK-8繼續(xù)孵育4 h，測定CD450值計算刺激指數(shù)。

取1×106個細胞定容至70 μL，依次加入10 μL抗體，4 ℃避光保存30 min，1 mL FACS緩沖液重懸4 ℃ 2000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀用300 μL FACS重懸過膜后,用流式細胞儀讀數(shù)。

2.6 免疫小鼠血清抗ADV抗體檢測 采用間接ELISA法檢測各組小鼠體內(nèi)的抗體水平，以ADV病毒包被，HRP標記兔抗水貂IgG作為二抗。

3 結果與分析

3.1 真核重組質(zhì)粒的構建及鑒定 以實驗室所保存的ADV分離強毒株DNA為模板，總上、428和446、總下分別為上下游引物，進行PCR擴增，分別擴增出大小約為3600 bp和870 bp的目的片段。以兩段PCR產(chǎn)物為模板，總上和總下為上下游引物，將兩段PCR產(chǎn)物融合為大小約為4500 bp的全長基因。用相同方法，獲得同時缺失428～446位與487～501位氨基酸的融合全基因(圖1)。將融合全基因與pcDNA3.1(+)載體連接，構建全基因突變真核重組質(zhì)粒。真核重組質(zhì)粒經(jīng)KPnI和NotI進行雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大小為4500 bp的目的基因片段，與預期結果相符(圖2)。

泳道1：總1-428段PCR產(chǎn)物；泳道2：446-總2段PCR產(chǎn)物；泳道3：切除428～446段融合產(chǎn)物；泳道4：250bp Ladder；泳道5：總1-487段PCR產(chǎn)物；泳道6:501-總2段PCR產(chǎn)物；泳道7：切除428～446、487～501段融合產(chǎn)物圖1 PCR和融合結果圖

泳道1：DL15000;泳道2：pcDNA3.1-ADV-428雙酶切產(chǎn)物；泳道3：pcDNA3.1-ADV-428-487雙酶切產(chǎn)物圖2 酶切結果圖

3.2 真核重組質(zhì)粒間接免疫熒光鑒定 將構建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428、pcDNA3.1-ADV-428-487分別轉染至L929細

胞后，經(jīng)熒光染色,觀察結果顯示, 轉染重組質(zhì)粒的細胞中均出現(xiàn)了特異性熒光,而轉染空質(zhì)粒和未轉染的細胞中則無熒光，說明構建的上述兩種重組質(zhì)粒在L929細胞中成功表達了目的蛋白(圖3)。3.3 免疫小鼠脾臟T淋巴細胞亞群測定 計算各組刺激指數(shù)，制作柱形圖(圖4)，由結果可見，A、B兩組實驗組和滅活苗組經(jīng)ADV刺激的淋巴細胞增殖效果要高于conA刺激組。而空載體組和PBS組ADV刺激的淋巴細胞增殖效果要弱于conA刺激。

經(jīng)流式細胞儀檢測后，各組小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群含量見表2、圖5，三免后各組CD3+T淋巴細胞亞群含量，兩實驗組和滅活疫苗組與空白組差異極顯著，A組與空載體組差異顯著，B、C組與空載體組差異顯著。三免后CD4+T淋巴細胞亞群含量C組與空載體組差異顯著。三免后CD8+T細胞亞群含量B組與空白組和空載體組都差異極顯著。

圖3 重組質(zhì)粒在L929細胞中的表達(400×)

圖4 小鼠脾臟淋巴細胞增殖比較

組別T淋巴細胞亞群含量/%CD3+CD4+CD8+A組46．1333±4．8335##??70．5333±5．896824．9333±4．1004B組42．9333±2．0502#??62．9667±2．573533．4667±1．6862##??C組40．6000±2．7713??#67．6333±5．6439#28．1667±5．6977D組24．7667±2．771359．6333±1．209626．4667±1．0693E組18．1333±0．838760．3667±0．929225．8000±1．0583

注：每組中的值表示為平均值±標準差，*表示與PBS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與PBS組差異極顯著(P<0.01)。#表示與pcDNA3.1空載體組相比差異顯著(P<0.05)A：pcDNA3.1-ADV-428 B：pcDNA3.1-ADV-428-487 C：滅活疫苗 D：空載體 E：PBS

圖5 T淋巴細胞亞群含量比較

3.4 免疫小鼠血清抗ADV抗體檢測 結果如圖6所示。圖為各組小鼠分別在第14、28、42、56天的抗體水平，A、B兩實驗組和C滅活苗組在第14天后抗體已經(jīng)有上升趨勢，在第42天達到峰值，隨后開始下降?？蛰d體組和PBS組，一直比較平緩，抗體水平?jīng)]有明顯的變化。

圖6 小鼠血清抗ADV抗體折線圖

4 討論與小結

水貂阿留申病能引起母貂空懷和仔貂死亡，使公貂的交配能力下降，感染水貂毛皮質(zhì)量下降，給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失，是養(yǎng)貂產(chǎn)業(yè)的三大疫病之一。由于其特殊的致病機理導致水貂阿留申病傳統(tǒng)疫苗的研制非常困難，目前尚沒有非常有效的對抗水貂阿留申病的疫苗。本實驗著眼于第三代新型疫苗——DNA疫苗的研究，針對其免疫效果好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點[12]研究對抗水貂阿留申病的新型疫苗。

水貂阿留申病病毒為單股線狀DNA病毒,基因組編碼有2個結構蛋白(VP1、VP2)，2個非結構蛋白(NS1、NS2),也可能存在NS3[13-14]。水貂阿留申病毒結構蛋白在病毒感染和引起免疫反應過程中起關鍵作用,非結構蛋白在病毒轉錄與復制過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，ADV NS1、VP2以及部分VP2片段的原核表達產(chǎn)物能引起較好的免疫反應，但是針對強毒攻擊的保護效果欠佳。Y Castelruiz等[15]所做研究中將NS1片段與真核表達載體連接制作的核酸疫苗在給水貂免疫后能起到部分保護效果,但保護力不足。與這些研究相比本試驗采用ADV全基因，通過切除片段、重組并與真核表達載體連接構建全基因突變重組質(zhì)粒。BLOOM等[16]所發(fā)表的文章以ADV VP2中各短序列作為實驗對象制作單克隆和多克隆抗體，以研究ADV各短序列在感染水貂的過程中所發(fā)揮的作用，結果表明，VP2蛋白428～446位肽段制備的單克隆抗體和多克隆抗體可產(chǎn)生明顯的抗原抗體復合物反應，而且428～446位肽段可能存在感染水貂的主要抗原表位，并能介導ADE反應的發(fā)生，所以428～446位肽段可能在ADV的致病機理中發(fā)揮著重要作用，而487～501位肽段形成復合粒子的水平類似于428～446位肽段。本實驗構建了截去428～446位氨基酸的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428和同時截去428～446位、487～501位氨基酸的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428-487。經(jīng)間接免疫熒光實驗，表明所構建的重組質(zhì)粒可在體外成功表達蛋白。在免疫小鼠后的抗體檢測發(fā)現(xiàn)，實驗初期五組實驗小鼠血清內(nèi)的抗體水平比較接近，隨后所構建的重組質(zhì)粒與滅活疫苗組開始呈現(xiàn)上升趨勢，并在第42天達到峰值，而空載體組與PBS組都無明顯變化，證明兩重組質(zhì)粒能成功誘導小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫。在小鼠的脾臟T淋巴細胞亞群測定中，pcDNA3.1-ADV-428、pcDNA3.1-ADV-428-487都對小鼠產(chǎn)生了明顯的刺激反應，各組小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群含量比較，實驗組CD3+、CD4+的含量值要明顯高于空載體組和空白組，實驗組的CD8+T含量略高于空載體組與空白組，表明所構建的重組質(zhì)粒能引起小鼠細胞免疫應答。本試驗所構建的兩種重組質(zhì)粒，在試驗中表現(xiàn)出良好的反應原性和免疫原性。

后續(xù)試驗將研究pcDNA3.1-ADV-428 和pcDNA3.1-ADV-428-487兩種重組質(zhì)粒對靶動物的免疫效果，觀察其接種水貂后，對水貂的保護情況，以期為水貂阿留申病核酸疫苗的研究奠定一定的基礎。

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(編輯：侯向輝)

ADV Isolated Virulent Strain Construction Expression and Immunogenicity Analysis of Whole Gene Mutation Recombinant Plasmids

SUN Li-jie1, LIU Dong-xu1, LI Jian-ming1, SHI Kun1, LENG Xue1, LI Dong1, DU Rui2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；2.GraduateSchoolofJilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

For the development of mink Aleutian disease nucleic acid vaccine, the nucleotide sequences encoding 428～446 bit amino acids in the ADV VP2 gene are removed by using the overlap extension PCR technique, with pcDNA3.1 (+) carrier connection,construct the whole gene mutation recombinant plasmid pcDNA3.1-ADV-428,on this basis, nucleotide sequences of 487～501 amino acid at position is truncated coding, construct the whole gene mutation recombinant plasmid pcDNA3.1-ADV-428-487.The recombinant plasmid was constructed by intramuscular injection of immune mice, anti ADV antibody levels were detected in 14 days, 28 days, 42 days, and 56 days after inoculation by indirect ELISA method; Detection of CD3+, CD4+and CD8+T lymphocyte subsets in spleen cells of mice forty-second days after inoculation by flow cytometry. Results showed that the number of CD3+, CD4+and CD8+T lymphocyte subsets in mice inoculated with plasmid were significantly increased, anti ADV antibody level reached peak at forty-second days. In this experiment, the immunogenicity of the recombinant plasmid of ADV gene mutation was tested to provide reference for the development of mink Aleutian disease nucleic acid vaccine.

aleutian disease of mink; eukaryotic expression vector; immunogenicity；reactionogenicity

國家自然基金(NO.31272565)

孫利杰，碩士研究生，從事經(jīng)濟動物疫病的研究。

杜銳。E-mail：durui197107@sian.com

2016-03-24

A

1002-1280 (2016) 06-0009-07

S858.299