包愛情，陸春波，林仙軍，陳曉林，蔡文金，金香蓮

(1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311101；2.上藥凱侖醫(yī)藥股份有限公司，杭州310000)

RP-HPLC雙波長(zhǎng)法測(cè)定四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量

包愛情1，陸春波1，林仙軍1，陳曉林1，蔡文金1，金香蓮2

(1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311101；2.上藥凱侖醫(yī)藥股份有限公司，杭州310000)

建立了反向高效液相色譜法檢測(cè)四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的方法。試驗(yàn)采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱( 4.6 mm × 250 mm，5 μm) ，以甲醇- 0.2%磷酸溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃；穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm；穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定范圍分別為2.32～37.14 μg/mL(r=1.0000)，2.00～31.94 μg/mL(r=1.0000)；加樣平均回收率分別為99.12%、98.84%；RSD分別為0.60%、0.62%；該方法方便、準(zhǔn)確、可靠，適用于測(cè)定四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。

四味穿心蓮散；高效液相法；穿心蓮內(nèi)酯；脫水穿心蓮內(nèi)酯；

四味穿心蓮散是以穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶四味藥材加工制成的中獸藥散劑，具有清熱解毒，除濕化滯的功效，用于瀉痢，積滯等。方中穿心蓮清熱解毒、消腫止痛，為君藥；葫蘆茶清熱解暑、消積利濕、殺蟲，辣蓼祛濕止瀉、散瘀止痛、祛風(fēng)殺蟲，共為佐使藥。諸藥合用，共奏清熱解毒、除濕化滯之功[1]。穿心蓮，又名春蓮秋柳，一見喜，欖核蓮、苦膽草、金香草、金耳鉤、印度草，苦草等。其中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯為穿心蓮的有效成份，具有祛熱解毒，消炎止痛之功效。穿心蓮內(nèi)酯更是對(duì)細(xì)菌性與病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊療效，被譽(yù)為天然抗生素藥物[2-3]?！吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》二○一○版二部(收載了四味穿心蓮散，對(duì)穿心蓮進(jìn)行了薄層鑒別，未對(duì)其進(jìn)行定量分析[4]。本文采用反向高效液相色譜法對(duì)四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，配Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司； XS-205電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇為色譜純，Merck 公司，其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q 超純水。穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(來源：中國(guó)食品藥品檢定檢驗(yàn)院，批號(hào)：110797-201108，含量：98.7%)；脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(來源：中國(guó)食品藥品檢定檢驗(yàn)院，批號(hào)：110854-201308，含量：99.7%)。四味穿心蓮散供試品(批號(hào)分別為20150901，20150902，20150903)，由浙江A廠生產(chǎn)；四味穿心蓮散供試品(批號(hào)分別為20160101，20160102，20160103)，由浙江B廠生產(chǎn)；四味穿心蓮散供試品(批號(hào)為20131001D)，由河北C廠生產(chǎn)。自制樣品：中藥飲片購(gòu)于上藥凱侖醫(yī)藥股份有限公司，經(jīng)浙江省獸藥飼料監(jiān)察所鑒定，按相應(yīng)處方自制。

2 方法與結(jié)果

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取穿心蓮內(nèi)酯11.76 mg和脫水穿心蓮對(duì)照品10.01 mg，分別置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取20 mL上述溶液于同一50 ml容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。精密量取混合對(duì)照品貯備液6.0 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取四味穿心蓮散1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加40%甲醇25 mL，超聲提取(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例自配不含穿心蓮的散劑，按其工藝制成陰性對(duì)照樣品，再按2.2.2項(xiàng)方法制備成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液注入液相色譜儀，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，記錄穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的光譜圖(圖1～圖2)；同時(shí)記錄混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液的色譜圖(圖3～圖8)。該色譜條件下，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯分離度良好，與其他峰分離良好，理論塔板數(shù)均大于6000。陰性樣品在混合對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上無吸收峰，表明處方中的其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果并無干擾，滿足定量檢測(cè)需要。峰1為穿心蓮內(nèi)酯，峰2為脫水穿心蓮內(nèi)酯。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯光譜圖

圖2 脫水穿心蓮內(nèi)酯光譜圖

圖3 混合對(duì)照品226 nm色譜圖

圖4 混合對(duì)照品252 nm色譜圖

圖5 自制陽性樣品226 nm色譜圖

圖6 自制陽性樣品252 nm色譜圖

圖7 自制陰性樣品226 nm波長(zhǎng)色譜圖

圖8 自制陰性樣品252 nm色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍 精密量取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯混合對(duì)照品貯備溶液(46.4、39.9 μg/mL)各0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，精密量取10 μL，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值(Y)對(duì)濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，方程為：

穿心蓮內(nèi)酯：Y=41467.11X+1698.00

(r=1.0000)，線性范圍2.32～37.14 μg/mL;

韓世玉等[6-11]研究表明，桑樹葉片生長(zhǎng)受桑樹種類或品種的影響；黃麗玲等[12-13]研究表明，桑樹葉片生長(zhǎng)受氣候條件的影響；許楠等[14-21]研究表明，桑樹葉片生長(zhǎng)受施肥水平等栽培管理水平的影響。桑樹新梢與葉片的生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)除受品種等內(nèi)部因素的影響外，還受氣候、土壤和栽培管理等外部因素影響。在生產(chǎn)中前一年要加強(qiáng)水肥管理，使樹體貯備足夠的養(yǎng)分，滿足次年新梢生長(zhǎng)和葉片生長(zhǎng)發(fā)育的養(yǎng)分需求。同時(shí)在新梢和葉片生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期加強(qiáng)水肥管理，為其提供良好的營(yíng)養(yǎng)條件。因此，在試驗(yàn)區(qū)條件下，合理施用催芽肥對(duì)促進(jìn)桑樹新梢和葉片生長(zhǎng)有著重要的作用。

脫水穿心蓮內(nèi)酯：Y=33757.20X+8960.78

(r=1.0000)，線性范圍2.00～31.94 μg/mL。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL,按上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算結(jié)果，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.32%，0.42%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(自制樣品)，分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積的RSD分別為0.54%、0.78%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(自制樣品)，分別稱取6份，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定供試品溶液中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。結(jié)果測(cè)得穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量分別為515.3、514.5、515.7、521.0、517.7、516.8 μg/g；脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量分別為339.2、341.8、345.2、345.5、338.3、343.9 μg/g；RSD分別為0.45%、0.24%。結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知含量的四味穿心蓮散樣品(自制樣品) 0.5 g，共6份，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加25 mL對(duì)照品溶液(稱取穿心蓮內(nèi)酯25.23 mg和脫水穿心蓮內(nèi)酯17.21 mg于同一100 mL容量瓶，甲醇溶解并稀釋至刻度，再精密量取10 mL于250 mL容量瓶中，用40%甲醇稀釋并定容到刻度)，其余按2.2.2項(xiàng)同法處理后，測(cè)定并結(jié)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 四味穿心蓮散回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的四味穿心蓮散，按2.2.2項(xiàng)下方法處理，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(μg/g) n=3

3 討論與小結(jié)

3.1 波長(zhǎng)的優(yōu)化 在波長(zhǎng)選擇上，通過二極管陣列檢測(cè)器(PDA)在200～400 nm進(jìn)行了全掃描，結(jié)果顯示穿心蓮內(nèi)酯在226 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，脫水穿心蓮內(nèi)酯在252 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)，因此本文采用雙波長(zhǎng)法，使兩者均有最大吸收。

3.2 提取方式的優(yōu)化 在提取方式選擇上，比較了浸漬、超聲和回流的提取效果，研究表明浸漬的提取效果略低于超聲與回流，而超聲與回流效果相當(dāng)，但超聲操作比回流便捷，因此本文采取超聲作為提取方式。

3.3 提取溶劑的優(yōu)化 在提取溶劑的選擇上，比較了20%甲醇，40%甲醇和60%甲醇的提取效果，研究表明當(dāng)提取溶劑為20%甲醇時(shí)，提取效率顯著低于40%甲醇和60%甲醇；當(dāng)提取溶劑為60%甲醇時(shí)，提取效果與40%甲醇無顯著差異，但雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，表明以60%甲醇提取時(shí)會(huì)將散劑中的一些其他成分提取出來而增加干擾，因此選用40%甲醇作為提取溶劑。

3.4 提取時(shí)間的優(yōu)化 在提取時(shí)間的選擇上，比較了15、30、45 min的提取效果，研究表明15min的提取效果顯著低于30、45 min，45 min的提取效果與30 min相當(dāng)，因此本文選用30 min的提取時(shí)間。

本文參考文獻(xiàn)[5-6]選用不同的比例的甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明，選用當(dāng)前試驗(yàn)的流動(dòng)相時(shí)，樣品中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯分離效果好、無雜峰干擾且時(shí)間短。已報(bào)道的關(guān)于四味穿心蓮散成分含量測(cè)定的只有汪艷秋[7]等人開發(fā)的HPLC法測(cè)定四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。本文開發(fā)的方法所需時(shí)間大大縮短，單針時(shí)間從45 min減少為20 min，檢測(cè)效率大幅提高，更節(jié)省溶劑同時(shí)減少對(duì)環(huán)境的污染，尤其適用于大批量檢測(cè)，且本文對(duì)自制陽性樣品以及多個(gè)廠家樣品進(jìn)行了測(cè)定，通過數(shù)據(jù)的比較反映出不同廠家樣品的區(qū)別。

當(dāng)前，我國(guó)中獸藥散劑多數(shù)采取顯微鑒別及薄層鑒別控制處方中各味藥材，未對(duì)中藥成分進(jìn)行定量測(cè)定。中藥材由于產(chǎn)地、氣候等因素的影響，差異往往很大，如本文中七批企業(yè)樣品，含量差異很大，究其原因，很可能是因?yàn)樗幉漠a(chǎn)地、氣候等因素的影響，但也不能排除個(gè)別企業(yè)不按照處方進(jìn)行制備。因此探索對(duì)中獸藥散劑中各味中藥的有效成分進(jìn)行的定量分析研究，有利于提高中獸藥散劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制，進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量。本文開發(fā)的方法，操作簡(jiǎn)便快捷，方法可行可靠，可為制定四味穿心蓮散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

[1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典二○一○年版二部[S].[2] Jiun-Han C,George H, An-Rong L,etal.Andrographolide suppresses endothelial cell apoptosis via activation of phosphatidyl inositol-3-kinase/Akt pathway [J]. Biochemical pharmacology, 2004,67(7): 1337-1345.

[3] Yi-Feng X,Bu-Qing Y, Yi-Dan L,etal. Andrographolide attenuates inflammation by inhibition of NF-kappa B activation through covalent modification of reduced cysteine 62 of p50 [J]. Journal of immunology, 2004,173(6): 4207-4217.

[4] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典獸藥使用指南二○一○年版中藥卷[S].

[5] 反任睿 , 張園園. 反向高效液相色譜法測(cè)定喉舒寧片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 中南藥學(xué), 2011, 9(4): 271-273.

[6] 馬冬云 , 姜文艷. 雙波長(zhǎng) HPLC 法同時(shí)測(cè)定止痢寧片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 中國(guó)藥師, 2012, 15(4): 497-499.

[7] 汪艷秋, 樓步青, 汪芳, 等. 獸用中成藥四味穿心蓮散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究[J]，中國(guó)獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2013, 6: 37-40.

(編輯：侯向輝)

Determination of Andrographolide and Dehydroandrographolide in Siwei Chuanxinlian San by Dual-wavelength RP-HPLC

BAQ Ai-qing1, LU Chun-bo1, LIN Xian-jun1, CHEN Xiao-lin1，CAI Wen-jin1，JIN Xiang-lian2

(1.ZhejiangProvinceInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou311101，China;2.ShangyaoKailunPharmaceuticalCoLtd，Hangzhou31000，China)

To establish a RP- HPLC method for determination of andrographolide and ehydroandrographolide in Siwei Chuanxinlian San，analysis was performed on a C18 column ( 250 mm × 4.6 mm，5 μm) with a gradient elution mode of methanol-0.2% phosphoric acid at a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30 ℃. The determination wave length of andrographolide was 226 nm while dehydroandrographolide was 252 nm. The linear range was 2.32～37.14 μg /mL(r=1.0000) and 2.00～31.94μg /mL (r=1.0000), and the average recovery was 99.12% and 98.84% withRSDof 0.60% and 0.62%, respectively.This method was convenient, accurate and reliable for the determination of andrographolide anddehydroandrographolide in Siwei Chuanxinlian San.

Siwei Chuanxinlian San; HPLC; andrographolide; dehydroandrographolide

包愛情，碩士，從事獸藥檢測(cè)工作。E-mail：baoaiqing@126.com

2016-04-07

A

1002-1280 (2016) 06-0056-05

S859.2