牟唐維，薛長定，魏明潔，張慧，張翥，蔣會會，王曉謙，彭遠義，王自力

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715)

黃芪生脈飲對模擬運輸應(yīng)激大鼠肺臟組織TLR4和NF-κB p50 mRNA表達的影響

牟唐維，薛長定，魏明潔，張慧，張翥，蔣會會，王曉謙，彭遠義，王自力*

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715)

為了探討模擬運輸應(yīng)激對大鼠肺臟組織TLR4和NF-κB p50 mRNA表達的影響及黃芪生脈飲的調(diào)控作用，本文將30只SD雄性大鼠隨機分為對照組、模型組和中藥組，給中藥組大鼠連續(xù)灌服黃芪生脈飲7 d，對照組、模型組灌服等量生理鹽水，然后將模型組和中藥組大鼠每日置于35 ℃、60 r/min的水平搖床搖晃2 h，連續(xù)3 d，模擬運輸過程中的搖晃、高溫、擁擠等因素，構(gòu)建大鼠運輸應(yīng)激模型，實時熒光定量PCR法測定大鼠肺組織TLR4和NF-κB p50 mRNA表達的變化。結(jié)果表明：模型組大鼠肺組織TLR4 mRNA表達量顯著低于對照組和中藥組(P<0.05)，中藥組大鼠肺組織TLR4 mRNA表達量顯著高于對照組(P<0.05)，模型組大鼠肺組織NF-κB p50 mRNA表達量顯著低于對照組和中藥組(P<0.05)，且對照組和中藥組NF-κB p50 mRNA表達量無顯著差異(P>0.05)。因此，黃芪生脈飲可通過降低大鼠肺臟組織中TLR4 mRNA的表達、增強NF-κB p50 mRNA表達來達到抑制TLR4-NF-κB信號通路的激活，進而控制下游的炎性信號通路及炎性細胞因子的表達，起到抑制運輸應(yīng)激大鼠肺組織炎癥的作用。

黃芪生脈飲；模擬運輸應(yīng)激；大鼠肺臟組織；TLR4；NF-κB p50

隨著現(xiàn)代畜牧集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，畜禽長途運輸變得越來越普遍，常引起動物出現(xiàn)運輸應(yīng)激，導(dǎo)致動物消瘦、驚恐、易怒、抗病能力下降，生產(chǎn)性能，免疫水平以及畜產(chǎn)品品質(zhì)降低[1]，特別是免疫抑制性疾病和誘發(fā)應(yīng)激動物嚴重的肺炎[2]，給畜禽生產(chǎn)帶來了巨大經(jīng)濟損失[3]。

現(xiàn)有研究表明，TLR4是參與非特異性免疫的重要蛋白質(zhì)分子，同時也是連接特異性免疫與非特異性免疫的橋梁，可識別病原微生物，激活機體產(chǎn)生免疫細胞應(yīng)答[4]，還可通過結(jié)合相應(yīng)配體引起信號的傳導(dǎo)，啟動炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，造成多種炎癥介質(zhì)的釋放[5],其中，NF-κB是TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游轉(zhuǎn)錄因子[6]，激活后將調(diào)控與炎癥反應(yīng)和固有免疫反應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[7]，可誘導(dǎo)下游信號的級聯(lián)式反應(yīng)，引起嚴重炎性反應(yīng)，導(dǎo)致疾病惡化[8]。因此，本文通過構(gòu)建大鼠模擬運輸應(yīng)激模型，研究模擬運輸應(yīng)激對大鼠肺臟組織TLR4和NF-κB p50 mRNA表達的影響及黃芪生脈飲的干預(yù)作用，探討黃芪生脈飲對運輸應(yīng)激致肺組織炎性損傷的防治效果，為研制可有效防治運輸應(yīng)激性肺炎的藥物提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 黃芪、五味子、黨參和麥冬,重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院；SYBR Green(批號：172-5264),美國Bio-Rad公司；RNAiso Plus(批號：D9108A)和RNA Reagent Kit(批號：DRR047R),大連寶生物公司；Trizol(批號：A9507-1)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：AK3101),大連TakaRa公司。

1.2 儀器設(shè)備 BIO-RAD7500型實時熒光定量PCR儀，HITACHI CT15RE型高速冷凍離心機，德國BIOMETRA Trobot PCR儀，SHZ-82恒溫振蕩培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 中藥制劑 取黃芪40 g、黨參30 g、麥冬20 g和五味子10 g等藥物加入10倍蒸餾水浸泡30 min后，武火煮沸，文火煎煮2 h后，雙層紗布過濾，再加入8倍蒸餾水文火煎煮1.5 h，紗布過濾后合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮為1 g生藥/mL的藥液，于4 ℃條件保存。

1.3.2 動物分組及處理 SD雄性大鼠30只，體重250±20 g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。將大鼠置于25±2℃，65%～75%濕度條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組、模型組和中藥組，每組10只。

按照5 g/kg劑量給各組大鼠灌服黃芪生脈飲2 mL，對照組和模型組大鼠灌服同等劑量生理鹽水，每日1次，連續(xù)7 d。參照文獻方法[9]對大鼠進行模擬運輸應(yīng)激處理，即每日9∶00～11∶00將模型組及中藥組大鼠置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，按35 ℃、60 r/min條件水平搖床上搖晃2 h，連續(xù)3 d，利用搖床模擬運輸過程中的搖晃、高溫、擁擠等因素進行處理。

1.3.3 樣品采集及處理 在第3天搖晃結(jié)束后，對所有大鼠進行乙醚吸入麻醉，頸椎脫臼處死后于75%酒精中浸泡5 min，無菌剖取肺臟組織，液氮凍存，-80 ℃保存；Trizol法提取肺組織總RNA反轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR法檢測大鼠肺組織中TLR4及NF-κB p50 mRNA表達量的變化。

1.3.4 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GeneBank中大鼠TLR4、NF-κBp50及β-actin基因序列，Primer 5軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。各基因引物序列如下：

表1 各基因引物序列

1.3.5 大鼠肺臟組織中TLR4和NF-κB p50 mRNA的檢測 提取大鼠肺臟組織的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA后，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)擴增目標(biāo)基因序列，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 min，95 ℃變性10 s，退火(TLR4 64.5 ℃、NF-κB p50 60 ℃、Actin 60 ℃)30 s，65 ℃延伸5 s，共進行39個循環(huán)，95 ℃延伸30 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 通過熒光定量PCR法測定各基因的熒光閾值(Ct)，運用2-ΔΔCt方法計算目的基因的表達值，并以“平均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差SD)”表示，采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 基因擴增曲線、溶解曲線結(jié)果 圖1-2為大鼠肺臟組織各基因擴展曲線和溶解曲線。擴增曲線均穩(wěn)定進入平臺期，說明模板的濃度適宜；溶解曲線呈單峰，表明無引物二聚體及其他的非特異性擴增產(chǎn)物，結(jié)果可信。

圖1 大鼠TLR4基因的擴增曲線(A)和溶解曲線(B)

圖2 大鼠NF-κBp50基因的擴增曲線(A)和溶解曲線(B)

2.2 黃芪生脈飲對模擬運輸應(yīng)激致大鼠肺組織TLR4 mRNA表達的影響

表2 黃芪生脈飲對模擬運輸應(yīng)激大鼠肺組織TLR4 mRNA表達的影響

各組之間相比，相同字母差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

由表2可知，模型組大鼠肺組織TLR4 mRNA表達量顯著高于對照組和中藥組(P<0.05)，中藥組大鼠肺組織TLR4 mRNA表達量則顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 黃芪生脈飲對模擬運輸應(yīng)激致大鼠肺組織 NF-κB p50 mRNA表達的影響

表3 黃芪生脈飲對模擬運輸應(yīng)激大鼠肺組織NF-κB p50 mRNA表達的影響

由表3可知，模型組肺組織NF-κB p50 mRNA表達量顯著低于對照組和中藥組(P<0.05)，對照組和中藥組肺組織NF-κB p50 mRNA表達量差異不顯著(P>0.05)。

3 分析與討論

運輸應(yīng)激是動物在運輸途中的禁食限水、擁擠環(huán)境及顛簸等因素的作用下，產(chǎn)生了適應(yīng)性和防御性反應(yīng)，是影響動物生產(chǎn)的重要因素之一[10]。據(jù)研究，長途運輸應(yīng)激會使動物呼吸系統(tǒng)免疫機制受到影響，易發(fā)生呼吸道、肺部感染性及炎性疾病[11-12]，引發(fā)肉牛全身綜合性病理癥候群，其發(fā)病率可達80%，死亡率達40%以上。

中獸醫(yī)理論認為運輸應(yīng)激綜合征屬于虛癥范疇，主要分為氣血兩虛、濕熱內(nèi)蘊、脾胃虛弱和肝氣郁結(jié)[14]等，臨床以氣血兩虛型較為常見，治宜益氣生津、寧心安神，可用歸脾湯、黃芪生脈飲等治療，黃芪生脈飲是由黃芪、黨參、麥冬和五味子四味藥組成，具有益氣滋陰，養(yǎng)心補肺之功效[15]。研究表明，黃芪生脈飲具有強心、改善周圍血液循環(huán)等作用，調(diào)節(jié)和促進機體活動能力，增強新陳代謝的功能[16]。

3.1 黃芪生脈飲對模擬運輸應(yīng)激大鼠肺組織TLR4 mRNA表達的影響 TLRs是啟動天然免疫防御反應(yīng)的關(guān)鍵因素，而TLR4是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TLRs家族之一，主要是識別革蘭氏陰性細菌的脂多糖，進而誘導(dǎo)下游信號通路，如NF-κB等信號通路來激發(fā)機體組織炎性反應(yīng)，在炎性反應(yīng)發(fā)生中起到關(guān)鍵作用[17，18]。

本研究表明，大鼠模型組肺臟組織TLR4 mRNA表達水平顯著高于對照組，說明在模擬運輸條件下，大鼠機體抵抗力下降，細菌感染導(dǎo)致肺組織受到損傷，模型組大鼠肺組織TLR4 mRNA表達水平顯著高于中藥組，說明黃芪生脈飲可通過干預(yù)大鼠肺臟組織中TLR4 mRNA的表達，進而控制TLR4下游的炎性信號通路及炎性細胞因子的表達，參與控制局部炎癥反應(yīng)，起到防治運輸應(yīng)激的作用。

現(xiàn)有研究表明，黃芪多糖對LPS引起的大鼠心肌肥大具有保護作用，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)[19]；黃芪皂苷可阻止MYD88，TLR4受體的激活，提高超氧化物歧化酶的活性，對于胃部炎癥具有治療作用[20]；黃芪可以減弱LPS-TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途中的p38和ERK的活性和激活增殖蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)從而減少LPS作用的巨噬細胞的IL-6、iNOS和COX-2的產(chǎn)生[21]；黨參對機體的部分損傷有保護作用，并且具有抗炎、抗應(yīng)激、抗缺氧作用[22]，還可使巨噬細胞增多，吞噬能力增強，可以增強細胞內(nèi)DNA、RNA、ATP酶等的活性等；麥冬可促進體液和細胞免疫功能[23]，增強小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力，具有良好的免疫增強和刺激作用；五味子也具有免疫興奮的作用[24]。

3.2 黃芪生脈飲對模擬運輸應(yīng)激大鼠肺組織NF-κB p50 mRNA表達的影響 NF-κB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，為p50/p65異源二聚體，在受到病原體等各種因素影響時被激活和釋放，可誘導(dǎo)前炎性基因表達，介導(dǎo)機體組織的天然免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)[25-26]；研究表明，NF-κB的負反饋調(diào)節(jié)主要通過p105/p50及IκBα執(zhí)行，其中p50二聚體可以通過競爭DNA結(jié)合位點降低NF-κB介導(dǎo)的效應(yīng)[27]。因此，抑制NF-κB信號通路的激活有助于控制組織炎癥的發(fā)生。

本研究表明，模擬運輸應(yīng)激可引起大鼠肺組織NF-κB p50 mRNA表達量顯著下降，且低于對照組和中藥組，中藥可維持大鼠肺組織NF-κB p50 mRNA表達量于正常水平，表明黃芪生脈飲能通過增強p105/p50介導(dǎo)的NF-κB的負反饋調(diào)節(jié)來抑制NF-κB信號通路，達到減輕肺部損傷的作用。研究表明，黃芪能夠抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，從而影響下游蛋白的表達并且黃芪皂苷能夠完全抑制LPS和TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的NF-κB核轉(zhuǎn)位和NF-κB-DNA結(jié)合的活性，從而發(fā)揮抗炎作用[21]；黃芪多糖聯(lián)合丹參酮對阻斷大鼠NF-κB轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度激活及降低細胞因子MIF(巨噬細胞移動抑制因子)具有顯著療效[28]；且黃芪甲苷對后負荷過載型心肌肥厚具有抑制作用，其作用機制與抑制TNF-α、IL-1β參與介導(dǎo)的TLR4-NF-κB通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[29]。

綜上所述，黃芪生脈飲可通過降低大鼠肺臟組織中TLR4 mRNA的表達、增強NF-κB p50 mRNA表達來達到抑制TLR4-NF-κB信號通路的激活，進而控制下游的炎性信號通路及炎性細胞因子的表達，參與控制局部炎癥反應(yīng)，起到抑制運輸應(yīng)激大鼠肺組織炎癥的作用。

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(編輯：陳希)

Effects of Huangqi Shengmai Decoction on TLR4 and NF-κB p50 mRNA Expression in Lung of Rat Injured with Transport Stress

MOU Tang-wei, XUE Chang-ding, WEI Ming-jie, ZHANG Hui, ZHANG Zhu,JIANG Hui-hui, WANG Xiao-qian, PENG Yuan-yi, WANG Zi-li*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

In order to investigate the effects of Huangqi Shengmai Decoction on TLR4 and NF-κB p50 mRNA expression in lung of rat injured with transport stress. There are 30 healthy male SD rats were divided in randomly into control group, model group and Chinese herb group. Then, the rats of Chinese herb group were irrigated Huangqi Shengmai Decoction for 7 d, while the rats of control groupand model group were irrigated normal salinein same dose. Then the rats of model group and Chinese herb group were put in simulated transport with 35 ℃, 60 r/min horizontal shaker for 3 d in order to simulate the transport process of shaking, temperature, congestion and other factors. And then the TLR4 and NF-κB p50 mRNA expression level in lung of rat were detected via real-time PCR. The results show that the model group TLR4 mRNA expression level in lung of rat is significantly higher than that of Chinese herb group and control group (P<0.05), while Chinese herb group is higher than control group in significantly (P<0.05). The expression level of lung tissue NF-κB p50 mRNA of the model group is lower than that of control group and Chinese herb group in significantly (P<0.05),while Chinese herb group and control group have no significant difference. Therefore, Huangqi Shengmai Decoction could decrease the TLR4 mRNA expression level, and increase the NF-κB p50 mRNA expression level of lung in rat,to restrain the activation of TLR4-NF-κB signal-pathway, then to control the inflammation signal-path way and cytokines expression, which will restrain the lung tissue inflammations of rat in transport stress.

Huangqi Shengmai Decoction; simulated transport stress; lung tissue of rat; TLR4; NF-κB p50

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛牦牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項基金資助(CARS-38);西南大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201410635009)

牟唐維，從事中獸醫(yī)學(xué)及中藥免疫藥理學(xué)方面研究。

王自力。E-mail：wzl9698@126.com

2016-04-20

A

1002-1280 (2016) 06-0039-05

S853.74