趙思思，胡慧艷，賈 青,2*，孫鳳莉，錫建中，李曉敏

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071000； 2.國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000； 3.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000)

河北太行雞不同群體含黃素單氧化酶3基因多態(tài)性檢測

趙思思1，胡慧艷1，賈 青1,2*，孫鳳莉3，錫建中1，李曉敏1

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071000； 2.國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000； 3.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000)

為了研究含黃素單氧化酶3(FMO3)基因T329S突變位點在河北太行雞不同群體中的等位基因及基因型頻率分布情況，采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析方法(PCR-RFLP)和DNA測序技術(shù)分別對贊皇、平山、唐縣地區(qū)3個河北太行雞群體FMO3基因及基因型頻率進行檢測。結(jié)果顯示，平山地區(qū)太行雞群體中未檢測到SS型個體，而平山、唐縣地區(qū)太行雞群體中均有FMO3基因SS型個體；贊皇、平山、唐縣3個太行雞群體中T等位基因的頻率分別為0.129 8、0.075 0、0.084 2，其頻率均遠低于等位基因A的頻率。獨立性卡方檢驗結(jié)果顯示，不同群體間基因型頻率分布差異不顯著；經(jīng)適合性卡方檢驗，贊皇、平山、唐縣3個太行雞群體卡方值分別為1.173 0(P>0.05)、0.035 1(P>0.05)、0.188 5(P>0.05)，說明該基因位點A→T堿基突變在3個群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；通過分析3個不同群體遺傳變異參數(shù)發(fā)現(xiàn)，3個太行雞群體在該基因位點上均處于低度多態(tài)(PIC<0.25)。以上結(jié)果表明，河北太行雞群體中FMO3基因型頻率較低，可以通過PCR-RFLP的方法予以剔除。

河北太行雞； 含黃素單氧化酶3基因； PCR-RFLP； 基因型頻率

含黃素單氧化酶3 (flavin-containing monooxygenase 3,FMO3)是一種重要的肝微粒體酶，在體內(nèi)主要參與外源性物質(zhì)和其他一些化學(xué)物質(zhì)的氧化代謝。FMO3基因多態(tài)性與多種疾病的發(fā)生密切關(guān)聯(lián)，其中以魚腥味綜合癥最為典型，因而FMO3基因又名魚腥味基因。Humbert等[1]首次報道了魚腥味綜合癥(又名“原發(fā)性三甲胺尿”)，為一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病。三甲胺(TMA)作為機體循環(huán)物質(zhì)，能夠被FMO3氧化代謝形成無毒的氮氧化合物被清除體外，但患有魚腥味綜合癥者機體會排出大量TMA[2]。由于TMA具有類似腐爛魚氣味，因而TMA也是污染環(huán)境的成分之一[3]。Lunden等[4]報道了牛FMO3基因第六外顯子上存在1個無義突變，導(dǎo)致該基因表達提前終止，突變個體產(chǎn)生魚腥味牛奶；Vondell等[5]首次報道了魚腥味雞蛋，這與雞的FMO3基因第七外顯子上存在的1個無義突變密切相關(guān)，該突變位點使得第694位堿基由A突變?yōu)門，引起329位氨基酸由蘇氨酸(T)突變?yōu)榻z氨酸(S)，故將該位點定義為T329S，此突變位點改變了該基因進化上的1個高度保守五肽基序FATGY，使得機體代謝TMA的FMO3活性下降，造成TMA氧化能力降低，從而使TMA不能排出體外。Hobsonfr等[6]于1973年證實了TMA是引起雞蛋魚腥味的主要物質(zhì)，并且攜帶魚腥味雞蛋蛋黃中TMA的含量為正常雞蛋蛋黃中含量的10倍，影響雞蛋的經(jīng)濟價值。王曉亮等[7]通過對10個地方雞種的研究發(fā)現(xiàn)，供試雞種均存在魚腥味綜合征易感個體，但易感基因型頻率都不高；馬旭東等[8]對引進高產(chǎn)商品蛋雞進行研究，結(jié)果表明，3個品種經(jīng)過選育后完全不含易感等位基因，表明該位點是可以通過分子標記手段將不利等位基因剔除，這對提高雞蛋品質(zhì)有重要意義。

太行雞(河北柴雞) 原產(chǎn)于河北的太行山區(qū)和山麓平原，中心產(chǎn)區(qū)主要在河北省西部的太行山區(qū)。太行雞屬于蛋肉兼用型，其蛋肉品質(zhì)優(yōu)良，營養(yǎng)成分含量豐富，具有適應(yīng)性強，耐粗飼等優(yōu)點，是河北省優(yōu)良地方品種[9]。隨著人們生活水平的不斷提高，地方雞種因具有蛋肉品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)成分含量豐富等自身獨特的優(yōu)勢，深受消費者的青睞。但目前關(guān)于太行雞FMO3基因T329S突變位點的研究尚未見報道，為此，采用PCR-RFLP對河北太行雞FMO3基因T329S突變位點進行檢測，分析該位點等位基因在不同群體中的分布情況，以期在分子水平上為太行雞選育過程中剔除魚腥味易感基因、提高蛋品質(zhì)提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

試驗樣品分別采自贊皇(104只)、平山(95只)、唐縣(100只)3個不同太行雞群體。采用真空采血管翅下靜脈采血1～2 mL，檸檬酸鈉抗凝劑處理后置于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提取試劑盒購北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶BsrⅠ購自NEB公司，TaqDNA聚合酶、DNA Marker購自北京TransGen生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中雞FMO3的基因序列(登錄號AJ431390)，獲得含T329S突變位點的序列信息[10]。應(yīng)用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件，針對T329S位點設(shè)計引物，引物序列為：F：5′-CAGGGTGGTATCAAGCCTGT-3′；R：5′-GATCCAAAGGACTGGACCAA-3′，由北京華大科技公司合成。

1.4 DNA提取及PCR擴增

全血DNA提取參照血液基因組提取試劑盒說明書進行。采用10 μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 7.1 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 0.8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL，DNA模板(100 ng/μL) 0.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取2 μL PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR擴增情況。序列測定由北京華大科技公司完成。

1.5 酶切反應(yīng)

繼代培養(yǎng)過程中2.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA組合培養(yǎng)基上長出了根，對組培苗馴化，將其移栽到自然環(huán)境中，有1株和其他香龍血樹明顯不一樣，在葉片上出現(xiàn)了金邊(圖5a)，而野生型植株葉色表現(xiàn)全綠(圖5b)，可能是體細胞變異，使香龍血樹表現(xiàn)型出現(xiàn)了差異，雖然市場上已經(jīng)有金邊香龍血樹，但該研究中的金色葉緣變異和現(xiàn)有的金邊性狀還存在很大差異，可能是一種新的變異類型。這種變異產(chǎn)生的原因是否屬于可遺傳的變異，以及后代能否100%保持這種變異還有待進一步研究。

采用PCR-RFLP方法檢測太行雞個體FMO3基因的基因型。酶切體系為10 μL：滅菌ddH2O 4 μL，10×Buffer 0.5 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，BsrⅠ限制性內(nèi)切酶0.5 μL。酶切溫度為67 ℃，反應(yīng) 2 h。PCR產(chǎn)物酶切完成后，經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照。

1.6 統(tǒng)計分析

采用POPGENE 32軟件分別計算不同太行雞群體該基因位點的遺傳變異參數(shù)，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行卡方檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴增

太行雞樣品基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一、整齊、清晰，亮度較好，無降解現(xiàn)象，即基因組DNA的完整性好(圖1)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(含0.05% GV)電泳檢測，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，PCR擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期片段(369 bp)大小一致，且沒有特異性擴增條帶，可直接用于PCR-RFLP分析。

圖1 血樣基因組DNA提取結(jié)果

圖2 FMO3基因PCR擴增結(jié)果

2.2 PCR擴增產(chǎn)物序列分析

為進一步提高基因分型的準確性，將PCR擴增產(chǎn)物測序，檢測A→T堿基突變情況(圖3)。該位點變異產(chǎn)生3種基因型，該位點的純合子命名為TT基因型和SS基因型，雜合子為TS基因型，此位點突變?yōu)殄e義突變，使得329位編碼的氨基酸由蘇氨酸(T)突變?yōu)榻z氨酸(S)，將該位點定義為T329S。

圖3 FMO3基因T329S位點測序圖譜

2.3 PCR-RFLP分析

[11]的結(jié)果，根據(jù)電泳圖帶型對太行雞個體進行基因型分型，只有 369 bp 1個條帶，即判定為SS型；出現(xiàn) 369、226、143 bp 3個條帶，即判定為ST型；出現(xiàn)226、143 bp 2個條帶，即判定為TT型。PCR產(chǎn)物酶切完成后，經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測可見，太行雞3個群體中FMO3基因SS型、ST型、TT型均有分布(圖4)。

圖4 河北太行雞FMO3基因突變位點的

2.4 遺傳分析

2.4.1 基因型頻率與基因頻率 由表1可知，河北太行雞3個群體中攜帶魚腥味綜合征易感基因型SS型及TS基因型個體所占比例遠遠小于TT基因型個體，均表現(xiàn)出TT>TS>SS的趨勢。贊皇、平山、唐縣地區(qū)3個群體中FMO3基因變異位點上檢測到T等位基因的頻率分別為0.129 8、0.075 0、0.084 2，其頻率均遠低于等位基因A的頻率。經(jīng)卡方適合性檢驗，贊皇、平山、唐縣地區(qū)3個群體卡方值分別為1.173 0(P>0.05)、0.035 1(P>0.05)、0.188 5(P>0.05)，說明該基因位點A→T堿基突變在3個群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。獨立性卡方檢驗表明，不同群體基因型頻率分布差異不顯著。

2.4.2 遺傳變異參數(shù) 由表2可知，贊皇太行雞群體的雜合度較平山、唐縣群體高，但3個太行雞群體在該基因位點上均處于低度多態(tài)(PIC<0.25)，表明3個群體在多態(tài)位點上的多樣性相似，將攜帶FMO3基因純合型(SS)和雜合型(ST)個體從群體中剔除相對較容易。

表1 不同群體FMO3基因變異位點基因及基因型頻率

表2 不同群體FMO3基因T329S的遺傳變異參數(shù)

3 結(jié)論與討論

本研究通過PCR-RFLP方法檢測了不同太行雞群體FMO3基因T329S位點多態(tài)性。結(jié)果顯示，該位點存在2個等位基因A、T。本試驗在平山太行雞群體中未檢測到SS型個體，可能是由于所選地方雞種為散養(yǎng)，采樣群體較小所致；在贊皇、唐縣太行雞群體中均檢測到3種基因型個體，其FMO3基因型SS型基因型頻率分別為0.028 8、0.010 5。這與劉偉等[11]、初芹等[12]的研究結(jié)果基本一致。通過遺傳變異參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，3個太行雞群體在該基因位點上均處于低度多態(tài)(PIC<0.25)，且不利等位基因T在3個太行雞群體中的頻率分別為0.129 8、0.075 0、0.084 2，其頻率均遠低于等位基因A的頻率。FMO3等位基因T在林甸雞、綠殼蛋雞、北京油雞群體中基因頻率平均為0.005～0.250[13-15]。本研究結(jié)果表明，在太行雞群體中，針對該位點等位基因在不同群體中的分布情況，是可以通過分子標記輔助手段加強選種選育，將攜帶FMO3基因個體剔除，這為今后在提高太行雞蛋品質(zhì)方面提供了重要的參考。

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Polymorphic Detections of Flavin-containing Monooxygenase 3 in Different Populations of Taihang Chickens in Hebei

ZHAO Sisi1,HU Huiyan1,JIA Qing1,2*,SUN Fengli3,XI Jianzhong1,LI Xiaomin1

(1.College of Animal Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China; 2.National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas,Baoding 071000,China; 3.Husbandry and Veterinary Research Institute of Hebei,Baoding 071000,China)

In order to study the distribution of T329S mutation in flavin-containing monooxygenase 3 (FMO3) in different populations of Taihang Chickens in Hebei.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) followed by DNA sequencing assay was used for detecting the frequency of genotype and allele ofFMO3 gene in three populations of Taihang Chickens.The results showed that no individual would lay fishy taint eggs in Taihang Chickens of Pingshan,fishy taint susceptible individuals with genotype SS were detected in another two groups.The frequency of T allele was 0.129 8,0.075 0 and 0.084 2,which was much lower than A allele,respectively.The Chi-square test result showed that there were no significant differences among the three populations with its genotype frequencies,and the Chi-square value were 1.173 0(P>0.05),0.035 1(P>0.05) and 0.188 5(P>0.05),which were fit with Hardy-Weinberg equilibrium in different populations of Taihang Chickens in Hebei.As for the genetic parameters showed that the three populations of Taihang Chickens were all intermediate polymorphism on this locus.In conclusion,the frequencies of fishy taint genotype of Taihang Chickens in Hebei was not high and the susceptible individuals could be easily detected by PCR-RFLP method.

Taihang Chickens in Hebei;FMO3 gene; PCR-RFLP; genotype frequencies

2016-04-26

河北省科技計劃項目(14236602D)

趙思思(1990-)，女，河北欒城人，在讀碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail:zssdk2314@163.com

*通訊作者：賈 青(1964-)，男，河北河間人，教授，博士，主要從事動物遺傳育種研究。E-mail:jiaqing@hebau.edu.cn

S831.2

A

1004-3268(2016)10-0134-04