靳丹虹，梁芳慧，牛艷秋，董麗丹，藺首睿，高雅靜長春醫(yī)學高等專科學校，吉林長春　130031

血清（尿）鈣檢測方法中影響因素的綜述

靳丹虹，梁芳慧，牛艷秋，董麗丹，藺首睿，高雅靜
長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林長春130031

血清（尿）鈣檢測能為臨床評價病患肌體鈣離子的代謝水平和疾病診斷提供重要的參考依據(jù)。通過對臨床常用血清（尿）鈣檢測的基本原理、影響測定結(jié)果的因素及改進措施等關鍵問題進行探討，為血清（尿）鈣檢測方法的改進和臨床準確檢驗提供參考。

尿鈣；血清鈣；檢測方法

［Abstract］Serum（urine）calcium detection can provide important reference basis for clinical evaluation of metaboilic level of body calcion of patients and disease diagnosis.The paper provides reference for the improvement and clinical accurate test of the serum （urine）calcium detection method by studying the key issues of the basic principle of the common serum （urine）calcium detection in clinic，influencing factors of test results and improvement measures.

［Key words］Urine calcium；Serum calcium；Test method

血清（尿）鈣的檢測是臨床常用的化驗項目，血清（尿）鈣的變化能反映機體鈣的代謝變化，血清鈣和尿鈣的變化具有一定的相關性，兩者對疾病的診斷、監(jiān)測和治療具有重要的臨床意義［1］。血清（尿）鈣檢測方法有多種，但是未見對分析原理和檢測結(jié)果準確度產(chǎn)生影響的各因素的探討。每種分析方法由于原理不同，血清（尿）標本成份復雜，存在的影響因素也各有差異。因此，有必要對臨床檢測過程中的各影響因素進行探討，為技術(shù)開發(fā)人員和化驗室分析人員對血清（尿）鈣檢測方法的改進和化驗室的臨床準確檢測提供參考。

1　EDTA滴定法

乙二胺四乙酸二鈉鹽簡稱EDTA。標本中的鈣離子在堿性溶液中與鈣紅指示劑結(jié)合生成可溶性的紅色絡合物，使溶液呈淡紅色；當用EDTA滴定液滴定已加入少量鈣紅指示劑的標本時，EDTA先與游離的鈣離子反應，當游離鈣離子較少時EDTA奪取紅色化絡合物中的鈣，鈣紅指示劑游離，溶液的顏色由鈣紅指示劑—鈣絡合物的紅色轉(zhuǎn)變?yōu)殁}紅指示劑的藍色停止滴定。根據(jù)血清（尿）的體積、EDTA滴定液的濃度和消耗的體積計算鈣的含量。EDTA滴定法能準確反映肌體24 h鈣的代謝變化值［2］。EDTA滴定法中用10%的NaOH溶液調(diào)pH 12～13，在此pH下鎂離子生成沉淀可以避免對鈣測定的干擾。鈣紅指示劑在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定褪色快，導致終點不易掌握，在NaOH中加入硫脲作為穩(wěn)定劑可以提高鈣紅指示劑在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性，延長退色時間。血清中少量的Mg2+，Hb，總膽紅素，脂濁對測定無影響［2-3］。

2　甲基百里香酚藍比色法

甲基百里香酚蘭（又稱甲基麝香草酚蘭，MTB）是一種優(yōu)良的金屬絡合劑。鈣離子在堿性溶液中與甲基百里香酚藍結(jié)合生成藍色的絡合物，利用藍色絡合物在可見光區(qū)對光的吸收值與標本中鈣的量成正比。甲基百里香酚藍比色法已有試劑盒在臨床使用［4］。標本中加入8-羥基喹啉能消除鎂離子對測定的干擾，標本中NaCl的濃度變化對血清鈣離子的測定有一定影響，離子強度增加鈣離子的測定產(chǎn)生正誤差，血清中少量的Mg2+、Hb、總膽紅素、脂濁對測定無影響［5］。

3　鄰甲酚酞絡合酮法

鄰甲酚酞絡合酮法為中等實驗室測定血清鈣的常規(guī)方法，鄰甲酚酞絡合酮（OCPC）在堿性溶液如二乙胺中能與鈣絡合生成OCPC-鈣紫紅色絡合物，OCPC-鈣紫紅色絡合物在575～600 nm附近有吸收峰，吸光度值與鈣的量成正比，絡合物的吸光度值在1 h內(nèi)穩(wěn)定［6］。

試劑8-羥基喹啉可以掩蔽鎂離子，8-羥喹啉易被氧化失去掩蔽Mg2+的作用，故工作液應新鮮配備使用或配成酸性儲備液試劑中加入KCN可以掩蔽Mg2+以外的其他重金屬，增加反應穩(wěn)定性［7］。孫慶艷等［8］的研究表明，堿性條件下鄰甲酚酞絡合酮不穩(wěn)定，加入二甲基亞砜作為穩(wěn)定劑，亦可使輕度脂血標本反應液澄清，并可消除蛋白影響。該法中鈣的測定結(jié)果與血液pH值呈負相關，樣本暴露于空氣中會引起pH變化，因此最好實時檢測。

試劑盒所需試劑的加入順序?qū)y定結(jié)果有一定的影響［9］，針對不同的產(chǎn)品在投入臨床檢驗前應對試劑的加入順序做對比研究。采用全自動生化儀測定鈣時有研究發(fā)現(xiàn)［10-11］測定其他項目使用的胱抑素C（CysC）試劑，尿酸酶-過氧化物酶偶聯(lián)法試劑等對鈣的測定有干擾。因此使用全自動生化分析儀時要注意對每項檢測所用器皿進行徹底清洗，避免交叉污染。

4　偶氮胂Ⅲ法

游離的偶氮胂Ⅲ（ArenazoⅢ）呈紫紅色，在堿性條件下ArenazoⅢ與鈣絡合形成藍紫色ArenazoⅢ—鈣的絡合物。當用EDTA滴定有少量ArenazoⅢ指示劑的標本時，EDTA與游離鈣結(jié)合完畢后，繼續(xù)滴入的EDTA將奪取ArenazoⅢ—鈣絡合物中的鈣，ArenazoⅢ—鈣絡合物被解離，在660 nm附件反應液吸光度的下降值與鈣濃度在一定范圍內(nèi)成正比，吸光度值在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

血清鈣檢測過程中黃疸較深、乳糜血的標本采用氮胂Ⅲ法測定時應做樣本空白對照試驗，少量的膽紅素、結(jié)合膽紅素、乳糜、抗壞血酸、血紅蛋白對實驗無明顯干擾［12］。采用全自動生化儀分析時其他測定項目中加入的生化試劑、酶類試劑或有酶促反應的試劑中所添加的EDTA、EGTA、檸檬酸鹽等螯合劑，若處理不當易發(fā)生交叉污染，標本盛放器皿選擇不當對測定亦能產(chǎn)生干擾［13-15］。

5　酶法分析

酶的選擇性高，一般酶只催化一種反應，或者說只能催化某種特定的化合物或?qū)μ囟ǖ幕瘜W鍵起作用［16］。Ca2+激活的豬胰腺α一直鏈淀粉酶方法，標本中的Ca2+可激活α-淀粉酶反應體系產(chǎn)生CNP，CNP濃度的增加與鈣離子濃度成正比關系，監(jiān)測反應體系405 nm處吸光度的變化可以獲得血清（尿）中Ca2+的含量。

脲酰胺酶（EC3，5，1，4，5）谷氨酸脫氫酶（GLDH，EC1，4，1，4）測定血清鈣和尿鈣。其反應機理可能是鈣影響了酶-ATP-Mg復合物對尿素的羧化，鈣和鎂以及鈣和三磷酸腺苷（ATP）之間的抑制是非競爭性的，這種酶的抑制作用與鈣離子濃度成正比，檢測340 nm處的吸光度變化可以獲得鈣離子濃度［17］。

豬胰腺α一直鏈淀粉酶法不受各種正離子特別是鎂離子、血清蛋白及其他物質(zhì)的影響，為了消除氯的影響，防止Ca2+與淀粉酶的過快結(jié)合在試劑中加入適量的NaCl和絡合劑BAPTA，GEDTA等［16］。采用脲酰胺酶（EC35.1.45）谷氨酸脫氫酶（GLDH.EC1.4.1.4）測定血清鈣，適宜的pH7.5～8.0，可以排除內(nèi)源性銨離子的干擾。試劑中加入適量NaCl及綜合劑（如GEDTA）可消除Cl-的干擾，調(diào)整Ca2+與酶的結(jié)合速度。脲酰胺酶法測定血清鈣時標本的黃疸較深和乳糜血等對結(jié)果影響較大，溶血、重度黃疸、嚴重脂血的標本應做樣本空白對照試驗，少量的NH4+、Mg2+對測定無干擾［17］。

6　離子選擇電極法

鈣電極是對離子鈣活度具有選擇性電位響應的一種離子選擇性電極。楊憲園等［18］采用離子選擇電極法測定血清和尿液中鈣離子濃度對失重性骨丟失進行評價。標本的pH對血清（尿）鈣測定結(jié)果有一定影響［19-22］。尿液在空氣中長時間放置pH值會升高將引起離子平衡的移動，導致尿離子鈣濃度下降，因此尿樣在分析前不宜在空氣中曝露放置過久。血清樣本在酸性條件下會促使蛋白結(jié)合鈣解離，使得測得的鈣濃度增高。當被測血清樣本的pH值偏堿性時，離子鈣和其他成分結(jié)合加強，使測得的血清鈣濃度降低。在實際工作中血液樣本長時間暴露在空氣中會導致pH值升高，此外體液酸堿紊亂患者的血清樣本直接測定血清（尿）鈣亦存在誤差，對上述情況將樣本pH值校準到7.4的標準離子鈣值能增加測定結(jié)果的準確度。該方法不受溶血、黃疸、脂血的干擾。

磷濃度對離子鈣的測定有明顯的負影響，磷的濃度達到或超過2.5 mmol/L時離子鈣測定結(jié)果明顯受到影響，此時臨床要綜合考慮測定所用的方法、血磷的濃度等情況來指導臨床的診斷和治療［22］。

7　原子吸收光譜法

原子吸收法是用于微量元素檢測的金典方法，在臨床應用廣泛［23］。標本中鈣元素對其特征譜線光的吸收強度與其量在一定條件下呈線性關系，因此利用原子吸收分光光度計可以對血清（尿）中的鈣進行定量分析。

在尿中存在著多種離子，在原子化過程中，可以形成穩(wěn)定的酸性復合物，從而降低鈣的原子化率［24］。鄧通洋等的研究［12，24］發(fā)現(xiàn)標本中加入試劑EDTA、SrCl2、氯化鑭、硝酸鍶等能消除尿液樣本分析中的化學干擾，提高鈣的原子化率，血清出現(xiàn)嚴重溶血不干擾測定結(jié)果。尿液較黃時，稀釋可降低尿基質(zhì)對鈣測定的干擾［25］。

原子吸收法光譜儀在使用中還要注意，每天要對標準曲線、燈的能量等進行校正，選擇合適的燈電流（最大工作電流的1/3～2/3左右）、燃燒器高度等儀器參數(shù)，確保檢測的準確度［25］。

8　流動注射法

流動注射分析是一種管道化的連續(xù)流動分析法。它主要包括將標本溶液注入載流，標本溶液與載流試劑混合和發(fā)生反應，與載流混合反應后的標本在持續(xù)進入系統(tǒng)載流的推動下恒速地流進紫外或熒光檢測器被檢測3個過程。

文獻報道［26］的流動注射法利用的載流與鈣的顯色劑有甲基麝香草酚藍、鈣色素等。甲基麝香草酚藍顯色法適宜的反應條件為:甲基麝香草酚藍的濃度0.08 mmol/ L，8-羥基喹啉的濃度2.0 g/L，聚乙烯吡咯烷酮的濃度1.5 g/L，鹽酸的濃度0.025 mol/L，無水亞硫酸鈉的濃度6.0 g/L，單乙醇胺的濃度5.5%。鈣色素顯色法適宜的測定反應條件為:鈣色素濃度為0.020%，氫氧化鉀溶液0.020%。

臨床檢測前流動注射法要根據(jù)實驗樣品的吸光度（熒光）強度選擇最佳的反應時間、反應管長度、載流流速等實驗條件，來確保檢測結(jié)果的準確度。

9　其他檢測方法

對血清（尿）鈣的檢測方法還有蘇氏試劑法、偶氮氯磷法等。熒光探針在其他體系中對鈣的測定研究正在廣泛開展［27-28］，試劑盒簡便宜操作適用于家庭的日?？焖贆z測［29］，未來或許會在血清（尿）鈣的臨床測定中廣泛發(fā)揮作用。

10　結(jié)語

血清（尿）鈣的檢測方法多樣，研發(fā)快速、準確、操作簡單適用于臨床準確檢測和家庭日常定期、快速檢測的儀器與試劑盒是檢驗儀器發(fā)展的目標。臨床檢驗和分析儀器研發(fā)人員不但要掌握血清（尿）鈣檢測方法的原理，同時應注意排除化驗中的各影響因素才能為臨床提供穩(wěn)定、準確、可靠的血清（尿）鈣結(jié)果。

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Review of Influencing Factors in the Serum（Urine）Calcium Detection Method

JIN Dan-hong，LIANG Fang-hui，NIU Yan-qiu，DONG Li-dan，LIN Shou-rui，GAO Ya-jing
Changchun Medical College，Changchun，Jilin Province，130031 China

R446

A

1672-5654（2016）05（a）-0195-04

靳丹虹（1965-），女，吉林通化人，本科，教授，主要從事檢驗儀器分析、分析化學的教育與研究工作。

2016-01-28）