張 帥 ， 李 蓓 ， 胡學遠 ， 范宏剛

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院， 黑龍江哈爾濱150030)

硫氫化鈉致大鼠肺損傷現(xiàn)象的觀察及對活性氧的影響

張 帥 ， 李 蓓 ， 胡學遠 ， 范宏剛

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院， 黑龍江哈爾濱150030)

為了研究常用劑量的硫氫化鈉(NaHS)致大鼠肺臟損傷程度以及與對活性氧(ROS)的影響，將96只SD大鼠隨機分為4組。各組大鼠分別腹腔注射生理鹽水、1 mg/kg體重NaHS、3 mg/kg體重NaHS、5 mg/kg體重NaHS后，于2、6、12 h和24 h 4個時間點分批處死，各組每個時間點處死6只大鼠。結果顯示，3個劑量的試驗組肺臟中的ROS含量均有升高，其中3 mg/kg體重和5 mg/kg體重NaHS能夠引起嚴重的肺損傷，1 mg/kg體重NaHS對肺的影響較小。本試驗表明NaHS所致的肺臟損傷與ROS的產(chǎn)生有關，NaHS干預肺臟相關的試驗的安全劑量應低于1 mg/kg體重。

硫氫化鈉 ； 肺 ； 活性氧

硫化氫(H2S)已成為繼NO和CO之后的第3類氣體信號分子，其在機體內可以參與多種生理過程[1]。研究證實，H2S在抗氧化應激[2]、清除自由基及抑制細胞凋亡等方面具有一定的功效[3]。硫氫化鈉(NaHS)作為一種外源性H2S的供體已經(jīng)廣泛應用于相關研究當中。在機體內，NaHS與H2S可以相互轉化，兩者以一種動態(tài)平衡狀態(tài)存在。NaHS能夠解離為Na+和HS-，HS-又與H+結合產(chǎn)生H2S[4]。但究其本質，H2S仍是一種有毒的氣體。在機體內高濃度的H2S能夠抑制細胞色素氧化酶活性，通過與細胞色素C氧化酶中的Fe3+結合，阻礙其還原為含F(xiàn)e2+的還原型細胞色素C氧化酶，從而阻斷呼吸鏈的電子傳遞和分子氧的利用，提高線粒體中活性氧(ROS)助氧化劑的水平，進而引起腦、肺、心、肝等重要臟器的代謝障礙及病理性損傷。因此，NaHS的毒性作用可能與ROS的產(chǎn)生水平有關。

肺臟因其特殊的肺泡結構和氣體交換功能，使之易于受到ROS的氧化應激的損傷[5-6]。然而，關于ROS在NaHS致大鼠肺臟中的毒性作用，國內外未見報道。本文就試驗常用劑量的NaHS致大鼠肺臟損傷程度以及與對ROS的影響進行研究，以期為臨床及肺臟相關試驗研究篩選一個相對安全的NaHS劑量范圍。

1 材料與方法

1.1 試驗模型的建立 選擇由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心提供的健康SD大鼠96只，體重(225±25)g，試驗前適應性飼養(yǎng)7 d，自由飲水和采食，保持良好的飼養(yǎng)環(huán)境。96只大鼠隨機分為4組，每組24只，并分別進行以下處理：對照組(等體積的生理鹽水，腹腔注射)、NaHS I組(NaHS 1 mg/kg體重，腹腔注射)、NaHS II組(NaHS 3 mg/kg體重，腹腔注射)、NaHS III組(NaHS 5 mg/kg體重，腹腔注射)，各組大鼠分別于注射NaHS后2、6、12 h和24 h四個時間點頸椎脫臼分批處死，每個時間點處死6只大鼠，冰上取肺臟組織備用。

1.2 試驗方法 (1)用購自南京建成生物工程研究所的ROS試劑盒測定大鼠肺臟內ROS濃度；(2)大鼠肺臟組織按常規(guī)切片及H.E.染色步驟處理；(3)取新鮮大鼠肺臟，表面吸干水分后稱重(濕重，W)，置于烤箱中烘烤至恒重(干重，D)，測定大鼠肺臟的干濕重比(W/D)：肺組織濕干重比(W/D)=濕重(W)/干重(D)。

2 結果與分析

2.1 肺臟組織干濕重比(W/D)測定結果 從圖1中可以看出，同一時間點各組間比較，在2 h時，NaHS II組和NaHS III組的W/D值與對照組相比，差異極顯著(P<0.01)；在6 h時，NaHS II組的W/D值最低，明顯低于對照組和NaHS I組，且差異極顯著(P<0.01)；在12 h時，NaHS III組的W/D值最低，明顯低于其他三組，且差異極顯著(P<0.01)；在24 h時，NaHS II組和NaHS III組與對照組相比，W/D值較低，且差異極顯著(P<0.01)，而NaHS I組的W/D值基本與對照組相同，差異不顯著(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義。

2.2 肺臟組織病理學變化結果 同一時間點各組間相比，對照組(見中插彩版圖2)大鼠的肺泡結構完整、清晰，肺泡間隔沒有腫脹現(xiàn)象；NaHS I組(見中插彩版圖3)大鼠的肺泡結構略有破壞，肺泡腔內可觀察到少量滲出物，并有炎性細胞浸潤，肺泡間隔與對照組相比有一定的腫脹；NaHS II組(見中插彩版圖4)以及NaHS III組(見中插彩版圖5)大鼠的肺泡結構明顯破壞,肺泡間隔與對照組和NaHS I組相比明顯增厚，并且有大量的炎性細胞浸潤及紅細胞滲出。并且，在NaHS II組和NaHS III組的大鼠肺臟組織中還可觀察到細支氣管的黏膜皺襞破損。相比之下，NaHS III組肺臟病變程度較NaHS II組的更加嚴重。2.3 ROS濃度測定結果 同一時間點各組間比較，在2 h時，NaHS I組的ROS含量與對照組相比，差異顯著(P<0.05)，NaHS II組和NaHS III組的ROS含量與對照組相比，差異極顯著(P<0.01)；在6 h時，NaHS I組和NaHS III組的ROS含量與對照組相比，差異極顯著(P<0.01)，NaHS II組的ROS含量與對照組相比，差異顯著(P<0.05)；在12 h，NaHS I組ROS含量最高，差異極顯著(P<0.01)，NaHS II組和對照組相比，差異不顯著(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義；在24 h，NaHS III組的ROS含量明顯高于其他3組，差異極顯著(P<0.01)，NaHS I組ROS含量基本恢復到正常水平，與對照組差異(P>0.05)不顯著，無統(tǒng)計學意義。

圖6 肺臟組織活性氧(ROS)濃度變化

3 討論

從肺臟病理切片結果來看，NaHS II組和NaHS III組的病理變化明顯，這與肺臟干濕重比結果相符，說明肺臟的病理變化與肺水腫有一定相關性。NaHS II組，在12時和24時，能看到炎性細胞浸潤和紅細胞滲出，而且肺泡結構破壞，肺泡壁腫脹，在3 mg/kg體重的注射劑量下，大鼠肺臟的W/D值與對照組相比存在顯著差異。NaHS III組的肺臟組織切片在各個時間點均表現(xiàn)出嚴重的病變，出現(xiàn)細支氣管黏膜皺襞破裂，肺泡壁腫脹甚至破裂，炎性細胞浸潤，血管腫脹等病理變化，說明5 mg/kg體重的NaHS對大鼠的肺臟存在嚴重的損傷作用，而且NaHS III組的W/D值與對照組相比存在顯著差異，均低于對照組的W/D值，說明NaHS以3 mg/kg體重和5 mg/kg體重的濃度注入機體后，不僅會引起肺水腫，還會引起肺炎的相關病理變化。張俊等通過肺臟干濕比和肺臟病理組織切片來進行肺損傷的程度評定[7]，所以本試驗組選用這兩個指標來判定NaHS對肺臟是否造成損傷。綜合以上兩個試驗，可以得出，不同濃度的NaHS會造成不同程度的肺損傷。

從ROS濃度的結果中可以看出， NaHS III組肺臟組織中的ROS含量基本都維持在一個較高水平，這與肺臟干濕比結果和肺臟病理切片結果基本保持一致，說明在5 mg/kg體重的注射劑量下，NaHS III組能使ROS的含量升高。此外，研究發(fā)現(xiàn)體內ROS升高與細胞色素氧化酶的活性受到抑制有關[8]。有學者認為，細胞色素氧化酶活性能夠因為缺氧及代謝障礙而降低，導致線粒體呼吸鏈中還原性中間體積聚在電子傳遞鏈中上游，從而引起整條電子傳遞鏈中缺失還原性中間體電子[9]，進而導致細胞內ROS升高。而大量的ROS可引起細胞毒性作用，從而造成機體產(chǎn)生氧化應激反應。所以，高劑量NaHS組的ROS水平高，可能是由于其造成呼吸鏈的損傷所導致[8]。而需氧量高的組織如心臟及含氧量高的組織如肺臟，對H2S影響氧化代謝的敏感性更高[10]。當細胞色素氧化酶活性降低時，細胞活性氧(ROS)等助氧化劑生成增多，對于肺臟這種含氧量高的組織來說，ROS可以導致非常嚴重的肺損傷。但是，NaHS II組和NaHS III組的ROS水平在2、6、12時呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，在24時卻呈現(xiàn)出上升趨勢，這可能是由于在2 h至12 h期間，H2S逐漸被機體所代謝，因此對細胞色素氧化酶的抑制作用逐漸減弱。但是隨著時間的推移，H2S對線粒體的損傷逐漸加重，所以使ROS的水平在24 h時呈現(xiàn)一個升高的趨勢。在NaHS I組，雖然能觀察到ROS水平有一定程度的升高，但是肺臟干濕比和病理切片結果都顯示肺臟組織沒有非常明顯的損傷。這可能是由于NaHS注入機體后，與細胞色素氧化酶中的Fe3+結合，有效的抑制線粒體呼吸，導致ROS水平升高。但所生成的ROS濃度較低并沒有造成嚴重的肺損傷，機體完全可以代償，肺臟組織沒有明顯病變。

綜合本試驗所有結果可以得出，3 mg/kg體重NaHS和5 mg/kg體重NaHS腹腔注射能夠對大鼠肺臟產(chǎn)生明顯的損傷作用，并且肺臟損傷程度與ROS濃度存在一定的相關性，而1 mg/kg體重組對大鼠的肺臟沒有明顯的損傷作用。因此，本試驗組認為NaHS所致的肺臟損傷與ROS的產(chǎn)生有關。NaHS干預肺臟相關的試驗的安全劑量應低于1 mg/kg體重。

4 結論

3 mg/kg體重NaHS和5 mg/kg體重NaHS腹腔注射能夠引起明顯的肺臟損傷，并且肺損傷程度與ROS濃度存在一定的相關性，而1 mg/kg體重NaHS對大鼠肺臟沒有造成明顯損傷。因此，推薦NaHS干預肺臟相關的試驗的安全劑量應低于1 mg/kg體重。

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Observation of lung injury induced by sodium hydrogen sulfide in rats and its effect on the reactive oxygen species

ZHANG Shuai ， LI Bei ， HU Xue-yuan ， FAN Hong-gang

(College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the effect of sodium hydrogen (NaHS) on lung injury and reactive oxygen species (ROS)，96 SD rats were randomly divided into 4 groups.Rats in 4 groups were given intraperitoneal injection by normal saline，1mg/kg，3mg/kg，and 5mg/kg NaHS respectively.Rats in each group were sacrificed at 2 h，6 h，12 h and 24 h and 6 rats in each group were executed at each time point.The results showed that 1mg/kg，3mg/kg，and 5mg/kg NaHS increase the production of ROS in the lung.NaHS at 5mg/kg and 3mg/kg caused severe lung injury.However，1mg/kg NaHS had little effect on the lung.The study shows that lung injury caused by NaHS is related to the production of ROS，and the safe dose of NaHS in the lung should be less than 1mg/kg.

Sodium hydrogen sulfide; lung; Reactive Oxygen Species

FAN Hong-gang

2016-05-26

黑龍江省博士后科研啟動金項目(LBH-Q14018)；東農(nóng)學者計劃“學術骨干”項目(15XG18)

張帥(1990-)，男，碩士生，從事動物麻醉與鎮(zhèn)痛工作，E-mail:835365791@qq.com

范宏剛，E-mail：fanhonggang2002@163.com

S857.1

A

0529-6005(2016)12-0084-03