楊守深 ， 孫 堅(jiān) ， 范克偉 ， 楊小燕 ， 廖曉萍

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 福建 龍巖 364012； 2. 福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 龍巖 364012； 3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

副豬嗜血桿菌同一質(zhì)粒攜帶blaROB-1和aacA-aphD耐藥基因

楊守深1,2， 孫 堅(jiān)3， 范克偉1,2， 楊小燕1,2， 廖曉萍3

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 福建 龍巖 364012； 2. 福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 龍巖 364012； 3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

探討1株副豬嗜血桿菌攜帶介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因blaROB-1耐藥質(zhì)粒的基因環(huán)境。抽提陽性菌的耐藥質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)法將耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α，運(yùn)用Southern blot確定耐藥基因blaROB-1的位置，通過測(cè)序獲得耐藥質(zhì)粒的基因組成結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該菌攜帶有2個(gè)質(zhì)粒，其中1個(gè)質(zhì)粒(pQY431-1)攜帶有耐藥基因blaROB-1，該質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入受體菌DH5α，轉(zhuǎn)化子較受體菌對(duì)阿莫西林、頭孢克洛、慶大霉素、卡那霉素以及阿米卡星的MIC分別提高了64倍、16倍、 32倍、64倍和2倍。該質(zhì)粒全長(zhǎng)為7 777 bp，其基因環(huán)境由潛在的移動(dòng)和復(fù)制區(qū)、一個(gè)截?cái)嗟腎SApl1插入序列、耐藥基因aacA-aphD和blaROB-1組成。

副豬嗜血桿菌；抗菌藥；耐藥基因；基因環(huán)境

副豬嗜血桿菌 (Haemophilusparasuis, HPS) 屬于革蘭陰性菌，主要引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎, 又稱格拉瑟病 (Gl?sser′s disease)。獸醫(yī)臨床上，β-內(nèi)酰胺類抗生素常被用于治療該病。本課題組對(duì)華南地區(qū)臨床分離的145株副豬嗜血桿菌進(jìn)行藥物敏感性分析，并對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中1株菌QY431攜帶有blaROB-1耐藥基因，對(duì)部分β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥，如青霉素、頭孢克洛，但是對(duì)頭孢噻呋(<0.064 μg/mL) 和頭孢噻肟(<0.064 μg/mL) 高度敏感；該菌還對(duì)氨基糖苷類藥物慶大霉素產(chǎn)生耐藥。因此，本文擬對(duì)該菌耐藥基因環(huán)境進(jìn)行研究，分析耐藥基因的組成結(jié)構(gòu)及其傳播機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TSA和TSB，購自O(shè)XOID公司；MH瓊脂和LB瓊脂，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；血清，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，添加量為5%。輔酶I，購自O(shè)miga公司，配置濃度為2 μg/mL。質(zhì)粒 DNA 提取試劑盒，購自德國QIAGEN公司；Southern雜交試劑盒，購自美國Roche 公司；ExTaq聚合酶，購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR引物合成由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.2 耐藥質(zhì)粒的提取和Southern雜交 質(zhì)粒DNA提取和Southern雜交均按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.3 電轉(zhuǎn)及轉(zhuǎn)化子鑒定 取2.5～5 μL質(zhì)粒DNA加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行脈沖(2.5 kV)電擊后，取100 μL涂布于含有10 μg/mL頭孢克洛的LB瓊脂上。挑取生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)是否含有blaROB-1基因(blaROB-1-F：5′-TGTTGCAATCGCTGCC-3′，blaROB-1-R：5′-TTATCGTACACTTTCCA-3′)鑒定其是否為陽性轉(zhuǎn)化子。

1.4 藥物敏感性分析 藥敏試驗(yàn)的測(cè)定參考NCCLS(2002)推薦方法，采用96孔酶標(biāo)板二倍稀釋法測(cè)定各菌株的MIC值，耐藥折點(diǎn)參考文獻(xiàn)報(bào)道[1]。大腸桿菌DH5α和轉(zhuǎn)化子藥物敏感性測(cè)定按照CLSI推薦方法(2010)。藥敏試驗(yàn)以胸膜肺炎放線菌 ATCC 27090和大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌。

1.5 質(zhì)粒測(cè)序 抽提轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，并測(cè)序，將結(jié)果通過DNAStar軟件中的EditSeq進(jìn)行序列拼接，然后提交NCBI。

2 結(jié)果

2.1 耐藥質(zhì)粒抽提及基因定位 成功抽提菌株QY431的質(zhì)粒，該菌含有兩個(gè)質(zhì)粒，分別是 ～7 kb和 ～6 kb，命名為pQY431-1和pQY431-2；通過電擊轉(zhuǎn)化的方法，質(zhì)粒pQY431-1成功轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，并抽提轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，原菌及轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒電泳圖見圖1中的 I。運(yùn)用地高辛標(biāo)記blaROB-1探針，通過Southern雜交技術(shù)，確定blaROB-1位于 ～7 kb的質(zhì)粒上，見圖1中的II。

圖1 質(zhì)粒電泳及Southern雜交圖

注：M：V517；I：1，QY431質(zhì)粒圖，2，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒圖；II：1 QY431質(zhì)粒雜交條帶，2，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒雜交條帶

2.2 轉(zhuǎn)化子的MIC結(jié)果 轉(zhuǎn)化子的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表1。轉(zhuǎn)化子與受體菌相比阿莫西林、頭孢克洛、慶大霉素、卡那霉素以及阿米卡星的MIC分別提高了64倍，16倍，32倍，64倍和2倍。其中轉(zhuǎn)化子對(duì)阿米卡星的MIC升高不明顯，僅從0.25 μg/mL上升到0.5 μg/mL，對(duì)鏈霉素的MIC不變。

表1 QY431、轉(zhuǎn)化子和受體菌的MIC比較

注：副豬嗜血桿菌對(duì)頭孢克洛、青霉素和慶大霉素耐藥折點(diǎn)分別是 ≥ 8 μg/mL，≥ 4 μg/mL和 ≥ 16 μg/mL

2.3 質(zhì)粒序列分析 pQY431-1完全測(cè)序，全長(zhǎng)為7 777 bp (KC405065)，由潛在的移動(dòng)和復(fù)制區(qū)、一個(gè)截?cái)嗟腎SApl1插入序列、耐藥基因aacA-aphD和blaROB-1組成，見圖2。從圖中還可得出pQY431-1與pFS39 (KC405064) 相比，除耐藥區(qū)中aacA-aphD不同外，其余組成部分相同。

圖2 質(zhì)粒pQY431-1與質(zhì)粒pFS39、pB1002和pB1000的基因環(huán)境比較

質(zhì)粒pQY431-1中ISApl1序列與pB1002相比在其內(nèi)部缺失了659 bp，然而，他們的3′ 和 5′ 端都完整保留見圖2。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，在ISApl1內(nèi)部有2個(gè)片段序列分別是TCGTTC和TCGTTTC，他們僅差一個(gè)堿基T，巧合的是在ISApl1截?cái)嗖糠终檬沁@兩段序列中間的區(qū)域和其中一段的TCGTTTC，見圖3。

圖3 質(zhì)粒pQY431-1截?cái)郔S Apl1的基因環(huán)境

3 討論

由于抗菌藥長(zhǎng)期不規(guī)范使用，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，常常造成獸醫(yī)臨床治療失敗。目前在副豬嗜血桿菌中僅發(fā)現(xiàn)兩種可介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的基因，分別是blaTEM型和blaROB-1[2]。其中，耐藥基因blaROB-1不僅介導(dǎo)青霉素，阿莫西林，氨芐西林耐藥，還可介導(dǎo)第二代頭孢克洛耐藥[3]；但是該耐藥基因?qū)Φ谌^孢菌素，如頭孢噻呋和頭孢噻肟高度敏感。本試驗(yàn)曾以工程菌J53、C600作為受體菌，研究質(zhì)粒pQY431-1的可轉(zhuǎn)移性。雖然不斷通過優(yōu)化共培養(yǎng)的條件，但是最終都未能獲得結(jié)合子。Gonzalez-Zorn等在研究質(zhì)粒 pB1000時(shí)，同樣以大腸桿菌作為受體菌，也未能獲得結(jié)合子[4]。這可能有很多因素影響結(jié)合試驗(yàn)，雖然副豬嗜血桿菌和大腸桿菌都屬于陰性桿菌，但是他們自身的生物學(xué)特性都差別很大。

序列分析發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒pQY431-1與pFJS5863 (HQ015159) 的同源率高達(dá)99%；與pFS39擁有相似的結(jié)構(gòu)，它們還與質(zhì)粒pHN61 含有相同的移動(dòng)和復(fù)制區(qū)[5]。以上質(zhì)粒可能從一個(gè)相同或相近的耐藥質(zhì)粒，經(jīng)過演變而來。細(xì)菌產(chǎn)生鈍化酶是對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥的重要耐藥機(jī)制之一，其中aacA-aphD基因編碼的修飾酶可引起慶大霉素、卡那霉素交叉耐藥，過度表達(dá)時(shí)還可對(duì)阿米卡星耐藥[6]。在本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化子對(duì)慶大霉素和卡那霉素的MIC較受體菌有明顯提高，但是對(duì)阿米卡星的MIC與受體菌相比僅從0.25 μg/mL增加到0.5 μg/mL。插入序列ISApl1 在胸膜肺炎放線菌AP76首次確認(rèn)并命名[7]，在質(zhì)粒pQY431-1中，插入序列ISApl1內(nèi)部缺失了659 bp，但兩端仍舊保留，該現(xiàn)象同樣在質(zhì)粒pFS39中發(fā)生。ISApl1對(duì)blaROB-1的移動(dòng)可能扮演著重要角色，ISApl1功能有待于進(jìn)一步深入研究。

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Co-location of the bla ROB-1 gene and aacA - aphD gene on a small plasmid in Haemophilus parasuis

YANG Shou-shen1,2, SUN Jian3, FAN Ke-wei1,2, YANG Xiao-yan1,2, LIAO Xiao-ping3

(1.College of Life Sciences, Longyan University, Longyan 364012, China; 2. Fujian Provincial Key Laboratory for the Prevention and Control of Animal Infectious Diseases and Biotechnology, Longyan 364012, China; 3. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China )

The purpose of this article was to analyze the genetic environment of theblaROB-1gene in oneHaemophilusparasuisstrain，which conferring resistance to β-lactam antibiotics. Plasmid DNA was extracted and introduced into anE.coliDH5α by electroporation. TheblaROB-1gene was shown by Southern blot hybridization. The plasmid was sequenced to analyze the genetic environment of the resistance gene. The results showed that the strain carryied two plasmids. One plasmid (pQY431-1) was successfully introduced into a DH5α recipient. The transformant showed 64-, 16-, 32-, 64- and 2-fold increases in the MICs of amoxicillin, cefaclor, gentamicin, kanamycin and amikacin, respectively, when compared with the recipient strain. It was 7777 bp long, consisting of the potential mobilization and replication region, a truncated ISApl1 and the resistance genesblaROB-1andaacA-aphD.

Haemophilusparasuis; antibiotics; resistance gene; genetic environment

LIAO Xiao-ping

2016-05-18

廣東省自然科學(xué)基金(S2012030006590)

楊守深(1982—)，男，講師，博士，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究，E-mail ：31526230@qq.com

廖曉萍，E-mail：xpliao@scau.edu.cn

S852.61

A

0529-6005(2016)12-0075-03