魯明騫 盧宏達(dá) 許新華 盧忠心 孔慶志 雷 章 徐冰清 李穎琦3

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430061)

槐耳清膏對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖及周期的影響

魯明騫1盧宏達(dá)2許新華1盧忠心2孔慶志2雷 章2徐冰清1李穎琦3

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430061)

目的研究槐耳清膏對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖及周期的影響。方法 制備濃度為0、3、6、9 mg/ml的槐耳清膏與人肺腺癌A549細(xì)胞作用后，采用流式細(xì)胞檢測(cè)觀察細(xì)胞凋亡率，并分析藥物干預(yù)36 h對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，槐耳清膏各濃度組均可發(fā)生細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。各濃度組可使人肺腺癌A549細(xì)胞G0/G1、S期細(xì)胞比例減少，G2/M期細(xì)胞比例增多。結(jié)論 槐耳清膏能誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖，可能與細(xì)胞被阻滯于G2/M期有關(guān)。

槐耳清膏； 人肺腺癌A549細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞周期

肺癌的治療以手術(shù)治療為主，由于缺乏早期癥狀和特異性診斷手段，大多數(shù)患者在確診時(shí)已屬中晚期而不能或無(wú)法手術(shù)〔1～3〕，雖然放療、化療和靶向藥物能使少數(shù)病人獲益，但因其毒副反應(yīng)的限制，尋找新的藥物或治療方法是肺癌治療迫切需要解決的首要任務(wù)。中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌已成為重要的治療手段〔4〕。細(xì)胞凋亡在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用〔5〕，槐耳主要活性成分為槐耳蛋白多糖，能誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡〔6～9〕。本實(shí)驗(yàn)探討不同濃度槐耳清膏對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞體外凋亡及周期的影響。

1 資料與方法

1.1 藥物制備 槐耳清膏由江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供，用無(wú)血清PRMI-1640培養(yǎng)液100 ml溶解槐耳清膏10 g，制備成濃度為0、3、6、9 mg/ml的槐耳清膏溶液待用，0 mg/ml作對(duì)照組。

1.2 細(xì)胞株 人肺腺癌A549細(xì)胞株由武漢市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室冷凍保存，10%胎牛血清、1%雙抗高糖DMEM培養(yǎng)，每2～3天進(jìn)行傳代1次，讓細(xì)胞處于呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。

1.3 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè) 不同濃度槐耳清膏與呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人肺腺癌A549細(xì)胞共同培養(yǎng)24、36、48 h后，清洗固定，離心加入100 μl磷酸二氫鈉/檸檬酸緩沖液室溫震蕩30 min，然后加入100 mg/L核糖核酸酶A(RnaseA)和25 mg/L碘化丙啶(PI)染色液1 ml，4℃染色3 h，用FACSort流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 槐耳清膏對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響 槐耳清膏各濃度組與A549細(xì)胞作用后均可發(fā)生細(xì)胞凋亡，在濃度為3、6、9 mg/ml作用24、36 h、48 h后細(xì)胞凋亡率，與對(duì)照組(0 mg/ml)相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

濃度(mg/ml)24h36h48h02 1±0 43 2±0 62 5±0 3314 5±4 31)37 2±3 61)20 2±1 51)611 5±1 51)27 8±3 11)15 4±1 61)99 6±1 31)24 7±2 61)12 5±1 61)

與0 mg/ml比較：1)P<0.05

2.2 槐耳清膏對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞周期的影響 槐耳清膏作用于人肺腺癌A549細(xì)胞36 h后，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布，槐耳清膏濃度為 3、6、9 mg/ml使細(xì)胞處于G0/G1期S期細(xì)胞比例分別比較對(duì)照組減少，G2/M期細(xì)胞比例增多，見(jiàn)表2。

表2 槐耳清膏各濃度組對(duì)A549細(xì)胞周期的影響(%，n=4)

組別(mg/ml)G0/G1SG2/M057 1641 870 97342 5447 629 84646 2347 256 52955 6142 781 61

3 討 論

槐耳是我國(guó)重要的藥用真菌類(lèi)抗腫瘤藥物之一，分布于河北、山東、陜西等地，由于野生資源稀缺，近年來(lái)江蘇等地采用固體發(fā)酵法培養(yǎng)槐栓菌以供藥用，研究發(fā)現(xiàn)槐耳清膏具有獨(dú)特的抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且毒性較小，對(duì)人體主要臟器無(wú)明顯不良損害。國(guó)內(nèi)外研究表明，槐耳清膏能抑制乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、骨髓瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔10～14〕。

凋亡抑制基因、凋亡促進(jìn)基因及凋亡效應(yīng)基因的上調(diào)和下調(diào)，都可能打破細(xì)胞生成和死亡的平衡〔15〕，隨著槐耳清膏濃度的增加，細(xì)胞抑制率反而下降，證明槐耳清膏濃度在3 mg/ml時(shí)抑制作用最強(qiáng)?；倍甯嗯cA549細(xì)胞作用36 h時(shí)抑制作用達(dá)到高峰，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制率逐漸下降，證明36 h是槐耳清膏作用最強(qiáng)的時(shí)刻。

細(xì)胞周期在正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中均有重要作用，王震等〔16〕在研究重樓皂苷對(duì)耐鉑人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷有促凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞阻滯于G2期。本研究結(jié)果顯示，槐耳清膏對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用可能與其導(dǎo)致G2/M期細(xì)胞阻滯有關(guān)。

崔洋等〔17〕在研究槐耳清膏對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，在藥物作用24 h和48 h后細(xì)胞活力均升高，而72 h細(xì)胞活力反而降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Zhang等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)槐耳清膏可以使乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的周期阻滯在G2期，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能通過(guò)bax-/bcl-2途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。綜上所述，槐耳清膏能顯著抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，濃度為3 mg/ml作用36 h后其抑制率能力最強(qiáng)。槐耳清膏可以使人肺腺癌A549細(xì)胞阻滯于G2/M期，從而使細(xì)胞周期阻斷，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討。

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〔2015-09-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(D20141205)；宜昌市科技研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(A12301-03)

孔慶志(1953-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤中西醫(yī)結(jié)合臨床及基礎(chǔ)研究。

魯明騫(1973-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤中西醫(yī)結(jié)合臨床及基礎(chǔ)研究。

R287

A

1005-9202(2016)24-6099-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.025

1 三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所 宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

2 武漢市中心醫(yī)院 武漢市腫瘤研究所 3 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院