袁紅霞 邱振宇 周 盾

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

姜黃素對(duì)5/6腎切除鼠鞘氨醇激酶1和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)的影響

袁紅霞 邱振宇 周 盾

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

目的探討姜黃素對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟損害的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。方法 將36只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，5/6腎切除組和姜黃素治療組，每組12只。10 w后檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)的水平；光鏡觀察各組大鼠腎組織病理改變，免疫組化法檢測(cè)腎組織鞘氨醇激酶(SPHK)1和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的表達(dá)。ELISA檢測(cè)各組大鼠血清中TGF-β1的分泌水平。結(jié)果 姜黃素治療組大鼠24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平明顯低于5/6腎切除組(P<0.05)。免疫組化檢測(cè)可見5/6腎切除組大鼠SPHK1和TGF-β1表達(dá)明顯增加(P<0.05)，姜黃素治療組上述指標(biāo)的表達(dá)均受到明顯抑制(P<0.05)。姜黃素治療組大鼠血清TGF-β1的分泌水平明顯低于5/6腎切除組，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 姜黃素能減輕5/6腎切除大鼠腎臟病理改變，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)和分泌，進(jìn)而影響SPHK1的表達(dá)而發(fā)揮作用。

姜黃素；5/6腎切除；鞘氨醇激酶1；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病發(fā)展至終末期的不可逆病變，其間涉及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子活化、細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)聚集等錯(cuò)綜復(fù)雜的病理生理過(guò)程〔1〕。姜黃素是從姜科植物根莖姜黃中提取的一種植物多酚，有抗氧化、抗炎、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。近年研究顯示，姜黃素具有抗腎纖維化的作用〔2～4〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立5/6腎切除大鼠動(dòng)物模型，觀察大鼠腎組織鞘氨醇激酶(SPHK)1和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的表達(dá)及姜黃素對(duì)其表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及試劑 健康成年雄性SD大鼠36只(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量250～300 g。姜黃素(Sigma公司)，兔抗大鼠SPHK1多克隆抗體(Abgent公司)，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(Santa Cruz公司)，SP免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。大鼠血清TGF-β1 ELISA試劑盒(沈陽(yáng)博瑞德科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組，5/6腎切除組和姜黃素治療組，每組12只。5/6腎切除組大鼠在麻醉和無(wú)菌條件下切除左腎上、下極約2/3腎組織,術(shù)后1 w，麻醉下切除右腎，兩次手術(shù)共切除腎臟約5/6。姜黃素治療組處理方法同5/6腎切除組，并于第2次腎切除后1 w開始行姜黃素150 mg·kg-1·d-1灌胃10 w。對(duì)照組和5/6腎切除組給予等體積飲用水灌胃。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理 10 w后，代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量；靜脈采血5 ml檢測(cè)血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)的水平及TGF-β1的分泌水平，后處死各組大鼠，留取腎臟組織標(biāo)本，用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。①24 h尿蛋白定量：雙縮脲法檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白定量。②腎功能指標(biāo)：全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清血SCr和BUN水平。③組織學(xué)檢查：取各組大鼠腎組織標(biāo)本石蠟切片行HE和PAS染色，觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)改變。④免疫組織化學(xué)檢測(cè)SPHK1和TGF-β1：采用SP法。石蠟切片4 μm。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，檢測(cè)SPHK1和TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每張標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算視野內(nèi)染色區(qū)域的平均吸光度，以均值計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的吸光度，最后以每組的均值進(jìn)行比較。⑤酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中TGF-β1的水平：按照試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 干預(yù)后各組大鼠24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平 干預(yù)10 w后，與對(duì)照組相比，5/6腎切除組24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平均明顯增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，姜黃素治療組24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平仍增高，但較5/6腎切除組顯著降低(P<0.05)。見表1。

組別24h尿蛋白定量(mg/24h)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)對(duì)照組12 63±6 425 44±1 2254 00±5 295/6腎切除組177 30±13 011)10，20±1 171)98 50±13 991)姜黃素治療組85 33±9 071)2)7 74±1 151)2)69 75±8 661)2)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與5/6腎切除組比較：2)P<0.05,下表同

2.2 各組大鼠腎組織病理改變 HE和PAS染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腎小球毛細(xì)血管襻開放較好，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)無(wú)明顯改變。5/6腎切除組可見腎小球系膜細(xì)胞增生，腎小囊擴(kuò)張，囊壁增厚，球囊粘連，毛細(xì)血管襻面積縮??；腎小管閉塞，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、顆粒變性、壞死、脫落，腎小管擴(kuò)張明顯，可見蛋白管型，個(gè)別小管萎縮，可見間質(zhì)纖維化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。姜黃素治療組病變較5/6腎切除組明顯減輕。見圖1。

2.3 各組大鼠腎組織中SPHK1和TGF-β1的表達(dá) 對(duì)照組大鼠腎小球和腎小管可見少量SPHK1和TGF-β1染色顆粒，5/6腎切除組SPHK1和TGF-β1表達(dá)明顯增加，姜黃素治療組SPHK1和TGF-β1蛋白表達(dá)與之相比明顯減少，但高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2，圖2、圖3。

2.4 各組大鼠血清TGF-β1水平 5/6腎切除組TGF-β1水平〔(249.5±45.33)pg/ml〕和姜黃素治療組〔(115.7±38.52)pg/ml〕明顯高于對(duì)照組〔(50.18±20.54)pg/ml,P<0.05〕；與 5/6腎切除組比較，姜黃素治療組TGF-β1水平降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠腎組織HE和PAS染色(×400)

表2 各組大鼠腎組織SPHK1和TGF-β1的表達(dá)

圖2 各組大鼠腎組織SPHK1的表達(dá)(×200)

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1的表達(dá)(×200)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠5/6腎切除誘導(dǎo)腎小球硬化模型，10 w后觀察到血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白定量升高，光鏡觀察腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，毛細(xì)血管襻面積縮?。荒I小管閉塞，個(gè)別小管萎縮，可見間質(zhì)纖維化。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所采用的模型已出現(xiàn)腎小球硬化的病理改變。

1磷酸鞘氨醇(S1P)作為SPHK1的下游代謝產(chǎn)物，能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、接觸和黏附、存活以及血管的形成，調(diào)控多種細(xì)胞的生物學(xué)活性〔5,6〕。最近，越來(lái)越多的研究證實(shí)，SPHK1在糖尿病腎病、多囊腎等腎臟病變腎組織表達(dá)增加并促進(jìn)腎臟硬化〔7～9〕。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠腎組織中可見少量SPHK1表達(dá)，5/6腎切除組SPHK1表達(dá)明顯增加，說(shuō)明SPHK1參與了腎局灶硬化和腎小管擴(kuò)張，但具體機(jī)制不清。

姜黃素是姜黃的主要活性成分，具有廣泛的藥理作用。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在5/6腎切除誘導(dǎo)的慢性腎衰竭模型大鼠中，姜黃素能顯著降低SCr、BUN及尿蛋白的水平，減輕腎局灶硬化和腎小管擴(kuò)張〔3,10〕，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。Ghosh等〔4〕在糖尿病腎病模型中研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能明顯下調(diào)SPHK1的表達(dá)和活性，使TGF-β1的過(guò)度表達(dá)受到抑制。另有研究證實(shí)，TGF-β1能促進(jìn)SPHK1的活性和表達(dá)，促使細(xì)胞外基質(zhì)的沉積〔11〕。TGF-β1是導(dǎo)致動(dòng)物腎臟纖維化的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，它能促進(jìn)系膜細(xì)胞肥大，細(xì)胞外基質(zhì)增多、降解減少，最終導(dǎo)致腎小球硬化。本研究發(fā)現(xiàn)，在5/6腎切除組大鼠腎組織中TGF-β1表達(dá)增多，血清分泌水平升高，提示TGF-β1和SPHK1可能共同參與了腎組織的病變。給予姜黃素治療后，大鼠腎組織中SPHK1和TGF-β1的表達(dá)減少，血清中TGF-β1的分泌水平顯著下降，說(shuō)明姜黃素通過(guò)TGF-β1/SPHK1通路起到了對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟的保護(hù)作用。

綜上，本研究表明姜黃素能改善5/6腎切除大鼠受損的腎臟結(jié)果和功能，降低蛋白尿，延緩慢性腎功能衰竭的發(fā)生和發(fā)展。其腎臟保護(hù)作用的機(jī)制可能是抑制TGF-β1的表達(dá)和分泌，進(jìn)而影響SPHK1的表達(dá)而發(fā)揮作用。

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〔2015-06-17修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

遼寧省教育廳科研項(xiàng)目(No.L2012312)

周 盾(1967-)，女，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腎小球硬化的發(fā)病及機(jī)制研究。

袁紅霞(1979-)，女，講師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事感染與免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制及治療研究。

R59

A

1005-9202(2016)24-6093-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.022