孫玉芝 雒曉東 趙貝貝 吳壽海 崔曉峰

(廣東省中醫(yī)院,廣東 廣州 510120)

核因子E2相關(guān)性因子2、血紅加氧酶-1蛋白在6-羥基多巴胺誘導(dǎo)帕金森病模型大鼠腦黑質(zhì)的動(dòng)態(tài)表達(dá)

孫玉芝 雒曉東 趙貝貝1吳壽海 崔曉峰2

(廣東省中醫(yī)院,廣東 廣州 510120)

目的觀察帕金森病(PD)模型大鼠腦黑質(zhì)組織核因子E2相關(guān)性因子2(Nrf2)、血紅加氧酶1(HO-1)蛋白的表達(dá)。方法 雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，每組按時(shí)間分為術(shù)后6、24、48 h、1、2、4、8 w 7個(gè)亞組。采用6-羥基多巴胺(6-OHDA)左側(cè)紋狀體兩點(diǎn)注射法建立PD大鼠模型，假手術(shù)組注射0.02%抗壞血酸溶液。Western印跡法檢測(cè)術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Nrf2核蛋白、HO-1蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)。結(jié)果 假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Nrf2核蛋白、HO-1蛋白低表達(dá)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)相比，6 h組Nrf2核蛋白表達(dá)升高，24 h組HO-1蛋白表達(dá)升高，Nrf2核蛋白與HO-1蛋白于均術(shù)后1 w達(dá)高峰，2、4、8 w有所回落，與假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較仍表達(dá)較高(P<0.01)。結(jié)論 6-OHDA造模后可以激活Nrf2核蛋白，進(jìn)而上調(diào)下游靶基因HO-1蛋白的表達(dá)，體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)被激活。

帕金森??；核因子E2相關(guān)性因子2；血紅加氧酶1

氧化應(yīng)激在帕金森病(PD)發(fā)病過程中具有重要地位。已有研究表明6-羥基多巴胺(6-OHDA)立體定向注射大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)，黑質(zhì)組織中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶含量降低，丙二醛及活性氧含量升高，提示氧化應(yīng)激損傷〔1〕。核因子E2相關(guān)性因子2(Nrf2)在細(xì)胞抵御內(nèi)源性、外源性氧化應(yīng)激機(jī)制中占有重要地位。正常生理狀態(tài)下，Nrf2在胞質(zhì)中與抑制因子Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)結(jié)合，在氧化應(yīng)激作用下，Nrf2與Keap1解離，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，調(diào)節(jié)其下游抗氧化基因血紅加氧酶1(HO-1)表達(dá)，保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。那么，在6-OHDA引起氧化應(yīng)激狀態(tài)下，大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)內(nèi)Nrf2蛋白是否能夠被激活？其下游靶基因HO-1是否能夠被激活？本研究采用神經(jīng)毒性物質(zhì)6-OHDA立體定向兩點(diǎn)注射左側(cè)紋狀體建立PD大鼠模型，動(dòng)態(tài)觀察PD大鼠中腦黑質(zhì)Nrf2核蛋白、HO-1蛋白動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、動(dòng)物及試劑 TL-251603型大鼠腦立體定位儀(美國，STOELTING)，SDS-PAGE垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)，核酸蛋白質(zhì)分析儀(美國Beckman公司)，蛋白質(zhì)濃縮儀(德國Eppendorf公司)，凝膠掃描系統(tǒng)DF-23B(英國UVP公司)。SPF級(jí)別SD雄性大鼠133只，體重220～240 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2008-0094。6-OHDA(Sigma公司)，阿撲嗎啡(APO，Sigma公司)，抗壞血酸(Sigma公司)，兔抗大鼠Nrf2抗體(Abcam公司)，兔抗大鼠HO-1抗體(Enzolife公司)，細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒(碧云天公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑配制 6-OHDA溶液：5 mg 6-OHDA溶解于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水1 ml中，質(zhì)量溶度為5 g/L，分裝后，避光保存-20℃冰箱。0.05%APO溶液：5 mg APO溶于生理鹽水10 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 動(dòng)物分組 雄性SD大鼠133只常規(guī)飼養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，然后按照術(shù)后6、24、48 h、1、2、4、8 w分為7個(gè)亞組，模型組各時(shí)間點(diǎn)11只和假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)8只。

1.2.3 PD模型制備 大鼠造模前經(jīng)APO(0.5 mg/kg)誘導(dǎo)確定無異常旋轉(zhuǎn)行為后采用左側(cè)紋狀體兩點(diǎn)注射6-OHDA制備PD模型，10%水合氯醛(0.35 ml/kg)大鼠腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜，確定左側(cè)紋狀體兩點(diǎn)坐標(biāo)，坐標(biāo)1：前囟前1.2 mm，矢狀縫左側(cè)2.2 mm，硬膜下4.0～6.0 mm；坐標(biāo)2：前囟后1.0 mm，矢狀縫左側(cè)4.4 mm，硬膜下4.5～6.5 mm，三棱針垂直鉆透顱骨，微量進(jìn)樣器吸取6-OHDA溶液3 μl，分別緩慢進(jìn)針達(dá)6.0 mm，6.5 mm處，在4.0～6.0 mm，4.5～6.5 mm之間以1 μl/min速度注射，注射完畢后留針15 min，以1.0 mm/min速度緩慢退針，縫合皮膚，術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素防止感染。假手術(shù)組注射等量0.02%抗環(huán)血酸生理鹽水溶液，余步驟相同。

1.2.4 模型成功標(biāo)準(zhǔn) 相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材前進(jìn)行APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測(cè)。受試大鼠頸背部皮下注射APO(0.5 mg/kg)誘發(fā)其出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，記錄開始旋轉(zhuǎn)后30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，計(jì)算旋轉(zhuǎn)速度，并觀察其行為表現(xiàn)。模型組術(shù)后6、24、48 h時(shí)間點(diǎn)大鼠經(jīng)APO誘發(fā)右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度≥4 r/min，1、2、4、8 w大鼠右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度≥7 r/min判定造模成功。

1.2.5 標(biāo)本采集 術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材，6-OHDA各時(shí)間點(diǎn)造模成功和假手術(shù)組分別抓取6只大鼠以10%水合氯醛麻醉，快速開顱取出腦組織，于冰盤上迅速分離左側(cè)中腦黑質(zhì)組織，-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.6 Western印跡檢測(cè)Nrf2細(xì)胞核蛋白、HO-1蛋白表達(dá) 左側(cè)中腦黑質(zhì)組織，冰上勻漿，分別提取總蛋白，細(xì)胞核蛋白并測(cè)定蛋白含量。將蛋白樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)不同分子量蛋白分離，專至PVDF膜上，5%脫脂奶粉(TBST配制)溶液室溫封閉1.5 h，再分別與兔抗大鼠Nrf2抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠HO-1抗體(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST溶液洗3次，后分別在二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，最后加入發(fā)光劑，顯影，曝光。膠片掃描后，使用ipwin32軟件分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參蛋白(GAPDH,Lamin)條帶灰度值比值作為該蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差分析及非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

假手術(shù)組Nrf2核蛋白，HO-1蛋白呈低表達(dá)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。6-OHDA造模后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比，Nrf2核蛋白在術(shù)后6 h表達(dá)即開始升高與假手術(shù)6 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨后逐漸升高，1 w達(dá)到高峰，2 w開始逐漸回落，4 w和8 w Nrf2核蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與假手術(shù)組相比仍較高水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HO-1蛋白在6-OHDA造模后6 h無明顯升高，與假手術(shù)組6 h比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，24 h升高，與假手術(shù)24 h，與PD造模術(shù)后6 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，隨后逐漸升高，1 w達(dá)到高峰，2 w開始逐漸回落，4 w和8 w蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.01)。見表1，圖1。

組別時(shí)間點(diǎn)Nrf2/LaminHO?1/GAPDH假手術(shù)組6h0 024±0 0070 190±0 02024h0 026±0 0070 193±0 01948h0 024±0 0051)0 195±0 0231w0 025±0 0061)0 197±0 0212w0 024±0 0051)0 200±0 0154w0 026±0 0071)0 196±0 0218w0 026±0 0051)0 194±0 022模型組6h0 032±0 0041)0 196±0 02424h0 048±0 0072)0 242±0 0122)48h0 070±0 0083)0 294±0 0193)1w0 144±0 0074)0 562±0 0414)2w0 118±0 0075)0 503±0 0275)4w0 095±0 0066)0 401±0 0216)8w0 092±0 0070 391±0 014

與假手術(shù)6 h組比較：1)P<0.05；與模型6 h組比較：2)P<0.01；與模型24 h組比較：3)P<0.01；與模型48 h組比較：4)P<0.01；與模型1 w組比較：5)P<0.01；與模型2 w組比較：6)P<0.01

A為模型組，B為假手術(shù)組圖1 Western印跡檢測(cè)大鼠左側(cè)中腦黑質(zhì)區(qū)Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的表達(dá)

3 討 論

雖然PD發(fā)病機(jī)制目前并不十分清楚，但既往研究中大家一致肯定氧化應(yīng)激損傷在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡中起到關(guān)鍵作用〔2〕。在正常情況下機(jī)體中存在谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等自由基清除系統(tǒng)，以確保機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷。PD患者腦內(nèi)ROS生成較正常人明顯增多。ROS可以通過直接誘導(dǎo)蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈的氧化，也可以通過脂質(zhì)過氧化間接誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，大量ROS破壞機(jī)體氧化-抗氧化平衡，機(jī)體失去正常調(diào)節(jié)功能。機(jī)體抗氧化系統(tǒng)較為復(fù)雜，但幾乎都與Nrf2相關(guān)，其在參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和外源性有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的主要防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用，是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)眾多抗氧化物表達(dá)的關(guān)鍵性因子。其中Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化通路，其能夠被外界各種氧化應(yīng)激條件誘導(dǎo)。Keap1是Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)合蛋白，正常情況下兩者相互結(jié)合，使Nrf2錨定在細(xì)胞質(zhì)處于失活狀態(tài)，無法進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制Nrf2活性〔3〕。但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，親電子物質(zhì)與Keap1的半胱氨酸殘基反應(yīng)，引起Keap1構(gòu)象發(fā)生變化，與Nrf2解離。另外蛋白激酶直接磷酸化Nrf2的方式促使其與Keap1分離，激活Nrf2。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核和肌腱纖維瘤蛋白(Maf)以異二聚體形式結(jié)合，之后與ARE結(jié)合，并誘導(dǎo)下游靶基因表達(dá)。受調(diào)控的靶基因主要包括多種解毒酶、抗氧化相關(guān)基因以及蛋白質(zhì)修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路，如谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、NAD(P)H：醌氧化還原酶Ⅰ、HO-1。Nrf2是CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，被認(rèn)為是活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子〔4〕。其中HO-1存在于宿主幾乎所有細(xì)胞中，對(duì)宿主細(xì)胞具有重要調(diào)節(jié)作用，可以催化血紅素生成鐵離子、CO、膽綠素，膽綠素在膽綠素還原酶作用下形成膽紅素。HO-1主要通過其催化血紅素分解而產(chǎn)生的三種物質(zhì)而發(fā)揮保護(hù)作用〔5〕。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鐵離子被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化損傷能力的保護(hù)劑，是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要鐵貯存蛋白，其重鏈具有抗氧化酶的活性〔6〕。膽紅素、膽綠素具有抗氧化能力，是體內(nèi)自由基清除劑〔7〕。

Nrf2、HO-1蛋白組成內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)參與體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激損傷，在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮重要作用。如果該通路失活則導(dǎo)致氧自由基在體內(nèi)積累，產(chǎn)生多種疾病，神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變就是其中之一。有研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)細(xì)胞中過表達(dá)Nrf2，能夠保護(hù)細(xì)胞減輕NO，H2O2和谷氨酸所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷〔8,9〕。另有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2缺失導(dǎo)致細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)降低，從而也增強(qiáng)了神經(jīng)元與星狀細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性〔10,11〕。因此可以推測(cè)上調(diào)Nrf2活性能夠減輕氧化應(yīng)激損傷。Shih等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)小鼠在發(fā)生腦缺血后，腦組織內(nèi)Nrf2表達(dá)增加，通過激活Nrf2/ARE通路增加腦組織內(nèi)GSH含量，減輕缺血帶來的損傷。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Nrf2核蛋白在6-OHDA所致PD大鼠模型的早期即被激活，隨后調(diào)控下游靶基因HO-1蛋白表達(dá)水平上調(diào)，說明神經(jīng)毒性物質(zhì)6-OHDA注射紋狀體后，術(shù)后早期機(jī)體應(yīng)對(duì)神經(jīng)毒性物質(zhì)的內(nèi)源性防御機(jī)制被激活，內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵因子Nrf2及下游靶基因HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)。氧化應(yīng)激作為PD重要發(fā)病機(jī)制之一，Nrf2、HO-1蛋白對(duì)防御和減輕氧化應(yīng)激損傷具有重要作用，尤其Nrf2作為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)許多抗氧化物表達(dá)的關(guān)鍵性因子，在維持細(xì)胞氧化-抗氧化平衡，抑制細(xì)胞凋亡的過程中起到重要作用。利用Nrf2表達(dá)及轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，上調(diào)其表達(dá)，誘導(dǎo)其下游調(diào)控多種抗氧化酶、解毒酶的表達(dá)，從而提高機(jī)體抗氧化能力，期望能夠成為PD治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

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〔2015-03-12修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)強(qiáng)省科研課題(No.20132150)

雒曉東(1961-)，男，碩士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥治療帕金森病的臨床研究。

孫玉芝(1978-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事中醫(yī)藥治療帕金森病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

R3

A

1005-9202(2016)24-6051-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.002

1 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 2 中山市黃圃人民醫(yī)院