劉 鏞 李斯璐 林 好

1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣東省東莞市 523808 2廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室 廣東省湛江市 524023

3廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 廣東省東莞市 523808 4廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 廣東省廣州市 510006

應(yīng)用ITS2序列對八角茴香及其混偽品的分子鑒定研究

劉 鏞1,2李斯璐3林 好4

1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣東省東莞市 523808 2廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室 廣東省湛江市 524023

3廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 廣東省東莞市 523808 4廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 廣東省廣州市 510006

目的：對中藥材八角茴香及其混偽品進(jìn)行分子鑒定，為控制藥材質(zhì)量和指導(dǎo)臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。方法：通過從GenBank數(shù)據(jù)庫下載中藥材八角茴香與其混偽品的DNA條形碼ITS2序列，利用MEGA6.06軟件進(jìn)行種內(nèi)、種間遺傳距離分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，應(yīng)用ITS2數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站預(yù)測其ITS2二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果：八角茴香與其混偽品的ITS2序列間存在明顯差異，基于ITS2序列的NJ樹及其ITS2二級結(jié)構(gòu)均可以將八角茴香與其混偽品明顯區(qū)分。結(jié)論：ITS2作為DNA條形碼序列能夠有效的鑒別八角茴香及其易混偽品。

八角茴香；DNA條形碼；混偽品；ITS2序列；分子鑒定

八角茴香為雙子葉植物藥木蘭科八角茴香（Illicium Verum）的干燥成熟果實，別名大茴香、廣茴香、大料，性辛、溫，具有溫陽散寒、理氣止痛、健胃止咳的功效[1]。近年來，市場上發(fā)現(xiàn)有用莽草（Illicium lanceolatum）、大八角（Illicium majus）、平滑葉八角（Illicium leiophyllum）、厚皮香八角（Illicium ternstroemioides）、紅茴香（Illicium henryi）、紅花八角（Illicium dunnianum）、野八角（Illicium simonsii）、地楓皮果實（Illicium difengpi）等偽品冒充正品八角茴香使用。而八角茴香的鑒定方法主要是從基原、性狀、顯微、理化等方面進(jìn)行鑒別[2]，這些傳統(tǒng)的鑒定方法對操作人員的專業(yè)知識要求較高，存在主觀性強(qiáng)、穩(wěn)定性與重復(fù)性較差等方面的不足，不能夠快速準(zhǔn)確地鑒別八角茴香及其混偽品，難以滿足中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的要求。因此，亟需建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的鑒定中藥材八角茴香及其混偽品的方法。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)是分子鑒定技術(shù)的最新進(jìn)展，它是指用標(biāo)準(zhǔn)的、短的DNA片段作為物種標(biāo)記而建立的一種新的生物物種鑒定方法，由加拿大動物學(xué)家、皇家學(xué)會會員Paul Hebert于2003年首先提出[3]。隨著分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對物種進(jìn)行鑒定已逐漸成為中藥材分類學(xué)的研究熱點[4]。其中，作為分子系統(tǒng)進(jìn)化研究中最重要的標(biāo)記之一，ITS2（internal transcribed spacer 2, ITS2）已被提出作為藥用植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列。然而，利用ITS2對八角茴香的相關(guān)鑒定研究尚未發(fā)現(xiàn)有專門報道。本研究利用ITS2序列對八角茴香及其混偽品進(jìn)行分子鑒定，為八角茴香的快速準(zhǔn)確鑒定及其開發(fā)利用和安全用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

本實驗所用材料包括八角茴香及其混偽品莽草、大八角、平滑葉八角、厚皮香八角、紅茴香、紅花八角、野八角、地楓皮果實共9個品種20份樣品，所用的ITS2系列來自Genbank下載，并且經(jīng)NCBI-Blast比對確認(rèn)為正確序列。

1.2 數(shù)據(jù)分析

用MEGA6.06軟件基于Kimura twoparameter（K2P）模型分析種內(nèi)、種間遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)鄰接樹 (Neighbor-Joining tree，NJ Tree)，并利用Bootstrap法[5]（1000次重復(fù)）檢驗各分枝的支持率，對八角茴香及其同科屬植物進(jìn)行鑒定分析。用Schultz等人的研究方法（http//its2. bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/cgibin/index.pl）預(yù)測各物種ITS2的二級結(jié)構(gòu)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角茴香及其混偽品種內(nèi)及種間差異分析

利用MEGA6.06軟件計算八角茴香及其混偽品種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離，可以得到基于K2P模型的遺傳距離（詳見表1），計算結(jié)果顯示八角茴香與其他混偽品的種間最小遺傳距離均明顯大于八角茴香的種內(nèi)最大遺傳距離，表明K2P遺傳距離可以鑒別八角茴香及其混偽品。

表 1：八角茴香種內(nèi)及其與混偽品種間K2P距離

2.2 八角茴香與其混偽品ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)分析

由圖1可知，八角茴香及其混偽品的ITS2序列二級結(jié)構(gòu)臂夾角幾乎類同，但是臂的長度、莖環(huán)大小、莖環(huán)數(shù)目以及環(huán)與環(huán)之間的距離均有差異。

2.3 NJ樹聚類分析

基于ITS2序列構(gòu)建的八角茴香及其混偽品的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）中可以看出，八角茴香獨立聚為一枝，與其它易混品可明顯區(qū)分（支持率均大于50%）。

3 討論

圖1：八角茴香及其混偽品藥用植物ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)比較

圖2：基于ITS2序列構(gòu)建的八角茴香與其混偽品的NJ樹

DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定以及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用研究已成為現(xiàn)代生物學(xué)最活躍的研究領(lǐng)域和新的熱點問題之一，也是未來物種鑒定的發(fā)展趨勢[7]。陳士林課題組在國內(nèi)率先提出將DNA條形碼技術(shù)用于中藥材的鑒定，并建立了藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關(guān)鍵技術(shù)分析[8]。基于ITS2的DNA條形碼技術(shù)為中藥材的快速準(zhǔn)確鑒定提供了誘人的前景，受到越來越多學(xué)者的關(guān)注[9]。

八角茴香中藥材在臨床與養(yǎng)生應(yīng)用十分廣泛，但市場上八角茴香的混偽品多而混雜。本研究基于ITS2條形碼序列研究八角茴香及其混偽品的種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以及分析ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)圖，能夠準(zhǔn)確區(qū)分八角茴香及其混偽品。因此，作為DNA條形碼的ITS2序列為準(zhǔn)確、簡便地鑒定八角茴香及其混偽品提供了新的分子鑒定方法，為控制藥材質(zhì)量穩(wěn)定和指導(dǎo)臨床合理用藥及中藥材的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:4-5.

[2]李峰,宋曉玲,劉亞魯.八角茴香及其混偽品的鑒別[J].山東中醫(yī)雜志, 2011,30(10):739-740.

[3]Hebert,P D,Cywinska A,Ball S L, et al,Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc Biol Sci,2003,270(1512):313-321.

[4]向婷婷,周志勇,劉朝奇,等.DNA條形碼鑒定藥用植物的研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥,2015,26(01):181-183.

[5]Tamura K,Nei M,Kumar S.Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighborjoining method[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(30):11030-11035.

[6]Schultz J,Muller T,Achtziger M, et al.The internal transcribed spacer 2 database--a web server for(not only)low level phylogenetic analyses[J].Nucleic Acids Res,2006,34(Web Server issue):W704-707.

[7]陳士林,龐曉慧,羅焜,等.生物資源的DNA條形碼技術(shù)[J].生命科學(xué), 2013,25(05):451-459.

[8]陳士林,宋經(jīng)元,姚輝,等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關(guān)鍵技術(shù)分析[J].中國天然藥物,2009,7(05):322-327.

[9]陳珂蕊,何震宇.DNA條形碼技術(shù)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,31(01):208-210.

劉鏞（1982-），男，廣東省茂名市人。碩士學(xué)位。現(xiàn)為廣東醫(yī)科大學(xué)講師。研究方向為中藥分子鑒定和分子藥理學(xué)。

林好（1992-），男，廣東省梅州市人?，F(xiàn)為廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生在讀學(xué)生。研究方向為中藥分子鑒定。

李斯璐（1983-），女，廣東省韶關(guān)市人。碩士研究生學(xué)歷?，F(xiàn)為廣東醫(yī)科大學(xué)講師。研究方向為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)。