趙忠偉 韓 鵬

(長春大學，吉林 長春 130022)

龍膽苦苷對人肝癌HepG2細胞的抑制作用

趙忠偉 韓 鵬1

(長春大學，吉林 長春 130022)

目的 觀察龍膽苦苷對體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細胞的抑制作用。方法 采用噻唑藍法(MTT)和流式細胞術(FCM)研究龍膽苦苷對HepG2細胞的增殖抑制作用和對細胞周期的影響。 結果 龍膽苦苷能夠抑制肝癌細胞的增殖，且呈劑量依賴性，半抑制常數(shù)IC50為107.93 μg/ml；隨著其作用濃度的增大，肝癌細胞期S和G2/M期細胞減少，G0/G1期細胞增多；Sub-G1期細胞變化明顯，出現(xiàn)明顯的凋亡峰。 結論 龍膽苦苷具有抑制肝癌細胞增殖和改變細胞周期分布的作用，對肝癌的中藥治療具有重要的指導意義。

龍膽苦苷；肝癌細胞；增殖抑制

肝癌惡性程度高、治療難度大、死亡率高。積極開展肝癌的中醫(yī)藥防治研究具有特別重要的意義。龍膽在我國資源豐富，屬大宗常用中藥材。臨床上龍膽具有瀉肝膽實火、清下焦?jié)駸岬墓π?，用于護肝、利膽、健胃、抗炎等〔1〕。最近有研究報道顯示龍膽還有抗腫瘤、抑制癌細胞生長的作用〔2,3〕。龍膽苦苷是龍膽植物中的主要藥理活性成分〔4〕，因此龍膽苦苷極可能是龍膽發(fā)揮抗肝癌作用的主要活性成分。本文初步研究龍膽苦苷對人肝癌HepG2細胞增殖和細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 龍膽苦苷購于柳河縣恒信北藥種植有限公司。人肝癌HepG2細胞株購于上海細胞所，由本實驗室傳代培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)液為Invitrogen公司產(chǎn)品，胎牛血清為四季青公司產(chǎn)品。四甲基偶氮唑藍(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細胞的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液加10 %胎牛血清，在37℃、5 % CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代，以備實驗使用。

1.3 體外細胞增殖抑制實驗(MTT法) 將對數(shù)生長期的細胞，以1×104個/ml的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板內，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h后去舊培養(yǎng)液，每個孔分別加入200 μl含有不同濃度(25、50、100、200 μg/ml)的龍膽苦苷培養(yǎng)液，每組4個復孔；陰性對照組中加入與加藥組等量溶劑的基礎培養(yǎng)液。經(jīng)過72 h的培養(yǎng)后吸棄上清，每孔加入150 μl MTT(5 mg/ml)的培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)孵育；4 h后吸棄上清液，每孔中加入150 μl DMSO溶液振蕩，在37℃完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長測定吸收值(A)，參考波長為630 nm。細胞生長抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4 流式細胞術(FCM)測定細胞周期 分別收集龍膽苦苷加藥組(龍膽苦苷濃度為100 μg/ml)和未加藥干預對照組的細胞，PBS清洗2次，經(jīng)80%預冷乙醇固定，在4℃冰箱中放置過夜；離心，棄除上清，將細胞沉淀經(jīng)PBS洗滌2次，加入不含DNA酶的100 g/ml 的RNase A重懸細胞，37℃培育30 min；再加入100 g/ml的PI染液在4℃避光孵育30 min，將樣品經(jīng)350目絹篩過濾，除去成團細胞，放入Coulter EPICS XL流式細胞儀檢測，對群體細胞中G0/G1、S和G2/M期細胞百分率及凋亡率進行分析。

2 結 果

2.1 龍膽苦苷對人肝癌HepG2細胞增殖的影響 MTT法檢測結果表明，龍膽苦苷能夠抑制HepG2細胞的增殖，25、50、100、200 μg/ml龍膽苦苷組HepG2細胞抑制率分別為(10.7±6.3)%、(29.3±5.3)%、(48.4±3.8)%、(89.4±5.1)%。隨著濃度的增加，抑制程度逐漸加強，IC50值為107.93 μg/ml。

2.2 龍膽苦苷對人肝癌HepG2細胞周期的影響 FCM檢測發(fā)現(xiàn)：龍膽苦苷作用HepG2細胞72 h后，細胞的S期和G2/M期細胞均減少，S期從34.4%降低到16.8%，G2/M期細胞從21.3%降低到12.5%，而G0/G1期細胞比例增加，從39.2%增加到50.4%。表明龍膽苦苷改變了肝癌細胞的周期分布，使HepG2細胞阻滯在了G0/G1期。

2.3 龍膽苦苷誘導人肝癌HepG2細胞凋亡 龍膽苦苷作用后，在G0/G1期前出現(xiàn)二倍體亞峰(Sub-G1)即凋亡峰，凋亡率由5.1 %增加到20.3%。

3 討 論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高、治療困難。中草藥來源廣泛，在肝癌的防治方面有一定優(yōu)勢，因此國內外對于肝癌的中醫(yī)藥防治都有著迫切需求〔5〕。

中藥龍膽具有健胃、利膽、護肝、抗炎、抗菌、升血糖、降壓及抗腫瘤等作用〔4〕。龍膽資源豐富，雖然作為健胃劑已經(jīng)在國際天然藥物界內被廣泛認可和接受，但其抗癌作用尚未引起足夠重視。有研究發(fā)現(xiàn)從龍膽中分離獲得的乙醇提取物具有抑制小鼠肉瘤、早幼粒細胞性白血病、卵巢癌、肺癌和肝癌等腫瘤細胞增殖的作用〔2,6,7〕；龍膽的熱水提取物也具有抑制腫瘤細胞增殖的作用〔8〕。龍膽苦苷是龍膽根及根莖中含有的主要化學成分，龍膽苦苷具有強烈的苦味活性，是龍膽藥苦寒的物質基礎，是評價龍膽質量的首要指標。龍膽苦苷屬裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物。有研究顯示，含有龍膽苦苷的中草藥提取物能夠抑制肝癌SMMC-7721細胞的增殖〔9〕。因此，筆者推測龍膽苦苷在龍膽發(fā)揮抗肝癌作用過程中起著很重要的作用。

腫瘤的發(fā)生是由于細胞生長和凋亡失調、細胞周期發(fā)生紊亂。所以現(xiàn)在通常認為肝癌細胞增殖的抑制和癌細胞周期的改變以及誘導癌細胞發(fā)生凋亡是目前抗肝癌的一種治療手段。本研究結果表明：龍膽苦苷能夠劑量依賴性抑制HepG2細胞的增殖；使HepG2細胞的G0/G1細胞增多，改變了肝癌細胞的周期；在此基礎上，還發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷可以誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡?？梢姡埬懣嘬諏τ诟伟┑闹委熜Чc龍膽苦苷對肝癌細胞增殖的抑制作用，和改變細胞周期分布及促進細胞凋亡的作用關系密切。

1 唐慶栓.龍膽的臨床研究進展〔J〕.齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2011;32(13):2156-7.

2 郭海鳳,樸惠順.關龍膽抗腫瘤活性實驗研究〔J〕.中藥材,2010;33(6):131-4.

3 蔣素強,任中海,李新民.龍膽膠囊體內外抗腫瘤作用的實驗研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志,1998;4(6):43-4.

4 曹斐華,李沖龍.龍膽屬植物化學成分及藥理作用的研究進展〔J〕.中國新藥雜志,2008;17(1):27-9.

5 陳 堅.中藥治療肝癌的實驗研究進展〔J〕.中西醫(yī)結合肝病雜志,2000;10(3):55-7.

6 郭海鳳,張善玉,樸惠順.關龍膽乙醇提取物對小鼠S180肉瘤的抑制增殖作用〔J〕.延邊大學醫(yī)學學報,2009;32(4):256-7.

7 Wu QX,Liu X,Shi YP.Chemical components from Gentiana aristata〔J〕.Chem Biodivers,2007;4(2):175-82.

8 Ozturk N,Korkmaz S,Ozturk Y,etal.Antiproliferative activity of root extract from Gentian plant (Gentiana triflora) on cultured and implanted tumor cells〔J〕.Biosci Biotechnol Biochem,2006;70(4):1046-8.

9 黃馨慧,羅明志,齊 浩,等.龍膽苦苷等6種中草藥提取物對SMMC-7721人肝癌細胞增殖的影響〔J〕.西北藥學雜志,2001;19(4):166-8.

〔2016-10-25修回〕

(編輯 曲 莉)

國家科技部科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金項目(11C26212200647)；吉林省道地藥材龍膽草基地建設

韓 鵬(1979-)，女，博士后，主要從事生物化學與分子生物學研究。

趙忠偉(1977-)，男，講師，主要從事中醫(yī)藥學研究。

R735.7

A

1005-9202(2016)24-6082-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.016

1 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院