陳松彪　張春杰　程相朝

(河南科技大學(xué)動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽471003)

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沙門菌減毒基因的研究進展①

陳松彪張春杰程相朝

(河南科技大學(xué)動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽471003)

①本文為河南省科技攻關(guān)資助項目(162102110054)。

沙門菌(Salmonella)屬于腸道致病菌，是一種重要的食物源性病原體，其具有廣泛感染的宿主譜，在公共衛(wèi)生方面具有重要的意義。用沙門菌作為重組疫苗的載體具有安全、免疫方式類似自然感染等無可比擬的優(yōu)越性。弱毒的沙門菌活疫苗可以經(jīng)口服途徑表達傳遞重組的抗原到機體的黏膜表面，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性的免疫應(yīng)答來對抗病原體的感染。近年來，出現(xiàn)的許多令人振奮的醫(yī)學(xué)新發(fā)現(xiàn)和新技術(shù)都是以減毒的沙門菌作為載體來實現(xiàn)的。本文結(jié)合國內(nèi)外近年來構(gòu)建的一些沙門菌減毒菌株進行說明，為進一步研制安全高效的沙門菌弱毒疫苗以及將其用作活載體表達外源基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1　沙門菌的研究狀況

沙門菌具有廣泛感染的宿主譜，據(jù)估計，每年有8.0×105～3.7×106不等數(shù)量的人感染沙門菌[1]，該菌能引起食物中毒和醫(yī)院內(nèi)感染流行、暴發(fā)，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)和公共衛(wèi)生上具有十分重要的意義。

近年來，利用基因工程技術(shù)將強毒株毒力相關(guān)基因敲除構(gòu)建新型減毒沙門菌作為疫苗的研究備受關(guān)注，采取基因工程方法減毒的沙門菌對人和動物的致病力顯著降低，但仍然保持良好的安全性和免疫原性。最早通過抗生素誘導(dǎo)對鼠傷寒沙門菌進行減毒，但所獲得的弱毒株毒力不穩(wěn)定，因而應(yīng)用起來不受歡迎，后來發(fā)展成為用化學(xué)誘變進行減毒，錢峰等[2]發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌的Ty2株經(jīng)誘變后可成為半乳糖差向異構(gòu)酶(Galactose epimerase,galE)基因缺失的營養(yǎng)缺陷型突變株，此菌株已獲準(zhǔn)用于人體，但是由于用化學(xué)誘變產(chǎn)生突變株很盲目，可能存在其他未知突變，其背景不清楚且可能出現(xiàn)毒力回復(fù)等，若用于疫苗制備，其質(zhì)量也不敢保證，所以此法也不被人們重視。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對沙門菌毒力遺傳學(xué)的深入研究和了解，為該病原體在基因組中引入多重、限定、減毒和不可回復(fù)的突變提供了可能性。為克服最早用于預(yù)防沙門菌病的滅活疫苗只能激發(fā)體液免疫、不能提供交叉保護、容易引起全身及局部反應(yīng)等缺陷，近年來人們通過基因工程方法構(gòu)建沙門菌減毒或無毒活菌疫苗免疫動物取得了比較好的效果。利用基因工程方法在沙門菌染色體基因組上隨機插入一個轉(zhuǎn)座子或刪除一段或幾段毒力相關(guān)基因，使編碼毒力因子或編碼關(guān)鍵代謝途徑的酶基因的序列發(fā)生改變，以及控制菌株在體內(nèi)生存的調(diào)節(jié)基因等均可使其毒力降低，但仍保留著高度的免疫原性。因此，應(yīng)用各種基因工程技術(shù)構(gòu)建減毒沙門菌作為弱毒疫苗已成為研究熱點。目前，許多與沙門菌致病相關(guān)的因子用于沙門菌的減毒，并已取得了不同程度的成功。

2　沙門菌毒力基因的研究概況

沙門菌的致病機理主要與位于Ⅲ型分泌系統(tǒng)上的編碼毒力島1(SPI-1)和毒力島2(SPI-2)上的一些毒力因子有關(guān)，Ⅲ型分泌系統(tǒng)在細菌進入宿主細胞中起著重要作用，這些蛋白被稱之為效應(yīng)蛋白，SPI-1上面的蛋白主要促進細菌黏附并進入宿主細胞，并且與細胞內(nèi)的炎癥發(fā)生有關(guān)，SPI-2上面的蛋白主要與細菌感染宿主細胞并在吞噬細胞內(nèi)存活和復(fù)制有關(guān)，由SPI-1和SPI-2上面的蛋白共同發(fā)生作用，從而引起全身性感染。目前許多研究者已經(jīng)利用沙門菌致病島SPI-1、SPI-2、SPI-3上面與毒力有關(guān)的致病因子進行了一系列的研究[3]。在沙門菌感染機體的過程中，SPI-1負責(zé)細菌對宿主的初期侵入，SPI-2對于細菌在吞噬細胞內(nèi)的生存是至關(guān)重要的。SPI-3致病島與鼠傷寒沙門菌繁殖和持續(xù)作用于腸黏膜有關(guān)。下面就位于毒力島上面一些減毒基因的國內(nèi)外近年的研究現(xiàn)狀進行闡述。

2.1cya基因cya基因編碼環(huán)化腺苷酸合成酶，該類減毒株能有效刺激機體產(chǎn)生黏膜免疫、細胞免疫和體液免疫應(yīng)答，李靜等[4]通過重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的細菌同源重組技術(shù)構(gòu)建鼠傷寒沙門菌環(huán)化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系統(tǒng)，生物學(xué)特性結(jié)果表明其毒力較親本菌株相比降低了104倍，免疫雛雞后對100LD50的野毒攻擊有60%左右的免疫保護率，有潛力開發(fā)為疫苗活載體。

2.2rpoE基因Rpo蛋白是目前研究最多的δ因子，它在穩(wěn)定生長期受到環(huán)境應(yīng)激時控制著基因表達，缺少rpoE基因可導(dǎo)致沙門菌對環(huán)境的抵抗力下降，生物被膜形成能力下降，黃駿等[5]通過RED重組方法構(gòu)建雞白痢沙門菌rpoE基因缺失株，生物學(xué)特性結(jié)果表明rpoE基因缺失株呈粉色干燥粗糙型，且熒光板的熒光強，說明產(chǎn)生纖維素，但不產(chǎn)生卷曲菌毛，且對環(huán)境的抵抗力發(fā)生了下降。

2.3ygaE基因最早在大腸桿菌中報道，在大腸桿菌中，gabC(來源于ygaE)被報道其屬于gabDAPC操縱子，是操縱子的抑制劑[6]，gab操縱子的功能主要與λ-氨基丁酸的分解代謝有關(guān)，但是不能分解代謝其他的氮源物質(zhì)[6]，然而對于ygaE基因在沙門菌中研究甚少，Schneider等[7]報道該基因能夠控制外膜蛋白OmpF/OmpC在高滲壓力下的早期階段和OmpA外膜蛋白的在高滲壓力下的后期階段。

2.4steA基因該基因是為數(shù)不多充當(dāng)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的基底之一，它位于SPI-1(毒力島1)和SPI-2(毒力島2)之間，Cardenal等[8]使用缺失該菌株的腸炎沙門菌去感染HeLa細胞發(fā)現(xiàn)會影響細胞外基質(zhì)的生物合成，調(diào)節(jié)細胞增殖，并且能夠影響絲氨酸/蘇氨酸激酶的信號通路。同時也能夠抑制與免疫相關(guān)基因的表達和調(diào)控嘌呤核苷酸的形成，并且與SMAD蛋白磷酸化的信號通路有關(guān)。

2.5sipB基因該基因是位于Ⅲ型分泌系統(tǒng)SPI-1上的一種效應(yīng)蛋白，主要與細菌的侵襲力有關(guān)，同時也與細胞的耐高滲有關(guān)，Hiroshi等[9]發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌LT2菌株的sipB基因缺失會顯著降低菌株的耐高滲性，生化特性試驗表明NaCl的等滲溶液能夠增加sipB缺失菌株細胞膜的膜拓撲異構(gòu)，親本菌株在滲透壓力的條件下能夠提高環(huán)丙烷脂肪酸的利用，另一方面有越來越多的證據(jù)表明SipB蛋白通路Caspase-1介導(dǎo)的通路激活I(lǐng)L-1b和IL-18來引起巨噬細胞的壞死和凋亡[10,11]。

2.6flgC基因該基因是構(gòu)成細菌鞭毛基底部的一個成分，Shippy等[12]采用轉(zhuǎn)座子的方法構(gòu)建出鼠傷寒沙門菌E2627 株flgC基因缺失菌株，生物學(xué)特性表明該缺失菌株生長速度較親本菌株和回復(fù)菌株相差不大，但其運動型發(fā)生了顯著的降低，對腸上皮細胞的侵入試驗表明該缺失菌株侵襲性發(fā)生了明顯的降低，進一步在雞體內(nèi)的動態(tài)分布試驗也顯示肝臟和脾臟中細菌數(shù)目也發(fā)生了顯著的降低。以上結(jié)果表明該基因在沙門菌感染家禽入侵腸黏膜方面發(fā)揮著重要的作用。

2.7stdA基因Shippy等[13]通過轉(zhuǎn)座子的方式構(gòu)建出腸炎沙門菌stdA基因缺失菌株，并將缺失菌株與親本菌株進行了生物學(xué)特性的比較，結(jié)果表明缺失株的生長速度與親本菌株相差不大，但是運動性較親本菌株相比發(fā)生了顯著的降低，通過體內(nèi)和體外試驗進行了侵襲性的檢測，結(jié)果與flgC突變株的結(jié)果相類似，對腸上皮細胞的侵入降低，動物試驗結(jié)果表明在小腸和盲腸細菌數(shù)均低于親本菌株組，在肝臟和脾臟上的細菌數(shù)也顯著低于親本菌株。

2.8sefA基因主要編碼SEF14亞單位菌毛，Zhu等[14]使用同組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的細菌同源重組技術(shù)構(gòu)建了sefA的缺失菌株，證實了該基因在SEF14菌毛體外和體內(nèi)的致病過程中所扮演的重要角色，與親本菌株50336相比sefA基因缺失菌株能夠提高小鼠腹腔巨噬細胞的存活，6周齡的BALB/c毒力實驗結(jié)果表明缺失株的LD50明顯升高。

2.9yncD基因主要編碼外膜上依賴TonB的轉(zhuǎn)運體，Xiong等[15]使用重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的細菌等位基因同源重組技術(shù)構(gòu)建出yncD基因缺失菌株，通過腹腔接種小鼠進行毒力測定，發(fā)現(xiàn)其毒力較親本菌株相比發(fā)生了顯著降低，免疫保護效力實驗結(jié)果顯示對104和105CFU的野毒攻擊能提供100%的保護率。

2.10aceE基因該基因主要編碼丙酮酸脫氫酶，Pang等[16]使用轉(zhuǎn)座子插入的方法構(gòu)建出腸炎沙門菌aceE基因缺失菌株，生物學(xué)特性研究表明該缺失菌株對腸上皮細胞的侵襲性降低，動物感染試驗表明缺失株對雞的毒力發(fā)生下降，完全致死劑量的野毒攻毒有50%的免疫保護率。

2.11ompR基因ompR基因主要與細菌的生物被膜形成有關(guān)，該基因缺失后會影響細菌生物被膜的形成，已有研究表明該基因還與細菌的毒力有一定的關(guān)系，缺失該基因后對小鼠的毒力會發(fā)生顯著的下降[17,18]，該基因缺失后仍能夠產(chǎn)生很高的IgG和IgA抗體，Dong等[19]發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌C50041缺失此基因后對野毒攻毒有62.5%的免疫保護率[19]。

2.12spiA 基因spiA基因參與沙門菌生物被膜的形成，董洪燕等[17]報道spiA基因是通過降低卷曲菌毛來調(diào)控腸炎沙門氏菌生物被膜的形成。spiA基因缺失株以及野生株的半數(shù)致死量為107.47和10.03，以100倍LD50野生株攻毒后spiA基因缺失突變株仍能保持50%的免疫保護效力。說明spiA基因缺失后通過影響細菌生物被膜的形成來達到減毒的目的。

2.13tpi基因該基因主要編碼糖酵解代謝過程中的磷酸丙糖異構(gòu)酶，主要通過影響和改變細菌的形態(tài)，從而影響其在動物體內(nèi)的增殖來達到減毒的目的，Gavin等[20]通過λRed重組系統(tǒng)，以鼠傷寒沙門菌SL1344為研究對象，構(gòu)建出了tpi基因的缺失菌株，并且利用原核載體pBR322構(gòu)建出缺失菌株的回復(fù)菌株，結(jié)果表明缺失該基因后菌株的某些生化特性發(fā)生了改變，并且形態(tài)較親本菌株相比也發(fā)生了變化，生長速度降低，在小鼠體內(nèi)動態(tài)分布試驗表明在肝臟和脾臟的侵襲力均發(fā)生了下降，免疫105CFU的缺失菌株后能有效抵御野毒株的感染。

2.14spiC基因該基因編碼的效應(yīng)蛋白在避免吞噬小泡與溶酶體融合機制中發(fā)揮極其重要的作用，有利于沙門菌在宿主巨噬細胞中的存活，SpiC效應(yīng)蛋白還能參與調(diào)控其他效應(yīng)蛋白的分泌，spiC基因缺失后導(dǎo)致細菌毒力下降。耿士忠等[21]構(gòu)建了雞白痢沙門菌spiC基因缺失菌株，生物學(xué)特性研究表明，該缺失菌株生化特性仍和親本菌株保持一致，生長速度略慢于親本菌株，對雛雞的毒力實驗顯示spiC突變株對雛雞的半數(shù)致死量比野生株提高了約154倍，毒力明顯下降，這為后期研究其作為減毒雞白痢沙門菌活疫苗的可能性奠定了重要基礎(chǔ)。

3　展望

以減毒沙門菌作為載體表達外源蛋白已成為當(dāng)今學(xué)者研究的一個熱點，它可以作為增強機體免疫力的一種方法，通過口服免疫使機體獲得持久的黏膜、體液和細胞免疫應(yīng)答，通過將同一種病原體的主要保護性抗原基因在弱毒的沙門菌體內(nèi)復(fù)制和表達，從而能夠以較小的免疫劑量來抵抗致病菌的感染，這種途徑相當(dāng)有效。重組的減毒沙門菌表達異源性抗原基因，然后機體經(jīng)口服攝入，誘發(fā)機體的免疫應(yīng)答來對抗由這些入侵體內(nèi)特定的病原體。與其他的細菌，如大腸桿菌，李斯特菌、志賀菌和弧菌相比，沙門菌侵襲的特性使它能輕易地誘發(fā)B細胞和記憶T細胞的免疫應(yīng)答，這些給了沙門菌能夠長期誘導(dǎo)機體持續(xù)的免疫應(yīng)答的潛能。

沙門菌是最早應(yīng)用于活疫苗載體的病原菌之一，也是研究最深入的活菌疫苗載體，已經(jīng)在防治多種疾病上顯示出了良好的應(yīng)用前景，但仍存在一些問題，如毒力返強、外源基因表達不如預(yù)期穩(wěn)定、質(zhì)粒DNA的危險性、宿主對抗原免疫應(yīng)答的負載能力不一等。目前對于沙門菌研究是一個熱點，很多沙門菌的二聯(lián)苗被廣泛的開發(fā)[22-24]。因此，通過對沙門菌毒力基因的深入研究，可為研制一個遺傳背景清晰、安全有效的沙門菌口服疫苗弱毒株，進一步將其開發(fā)為適于黏膜免疫的口服多價疫苗載體提供新的思路。今后的目標(biāo)是開發(fā)更有優(yōu)勢的技術(shù)來進一步完善沙門菌載體技術(shù)，為活菌載體技術(shù)和疫苗研發(fā)工作帶來新的契機。

[1]Chalker RB,Blaser MJ.A review of human salmonellosis:III.Magnitude of Salmonella infection in the United States[J].Rev Infect Dis,1988,10(1):111-124.

[2]錢鋒.以減毒沙門菌為載體的疫苗研究[J].國外醫(yī)學(xué)寄生蟲病分冊,1998，25(1):9-13.

[3]Roland KL,Brenneman KE.Salmonella as a vaccine delivery vehicle[J].Expert Rev Vaccines,2013,12(9):1033-1045.

[4]李靜，陳松彪，余祖華，等.鼠傷寒沙門菌SL1344株CAMP合成酶缺失株平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及其生物學(xué)特性[J].微生物學(xué)報，2015,55(7):674-678.

[5]黃駿，陳素娟，黃凱，等.雞白痢沙門菌生物被膜形成相關(guān)基因rpoE的鑒定[J].微生物學(xué)報,2015,55(2):156-163.

[6]Wang M,Feng P,Chen X,etal.YgaE regulates out membrane proteins in salmonella enterica serovar typhi under hyperosmotic stress[J].The Scientific World J,2014,2014(10):1-9.

[7]Schneider B L,Ruback S,Kiupakis A K,etal.The Escherichia coli gabDTPC operon:specific gamma-aminobutyrate catabolism and nonspecific induction[J].J Bacteriol,2002,184(24):6976-6986.

[8]Cardenal-Munoz E,Gutierrez G,Ramos-Morales F.Global impact of Salmonella type Ⅲ secretion effector SteA on host cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,449(4):419-424.

[9]Asakura H,Ekawa T,Sugimoto N,etal.Membrane topology of Salmonella invasion protein SipB confers osmotolerance[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,426(4):654-658.

[10]Obregon C,Dreher D,Kok M,etal.Human alveolar macrophages infected by virulent bacteria expressing SipB are a major source of active interleukin-18[J].Infect Immun,2003,71(8):4382-4388.

[11]Dreher D,Kok M,Obregon C,etal.Salmonella virulence factor SipB induces activation and release of IL-18 in human dendritic cells[J].J Leukoc Biol,2002,72(4):743-751.

[12]Shippy DC,Eakley NM,Mikheil DM,etal.Role of the flagellar basal-body protein,FlgC,in the binding of Salmonella enterica serovar Enteritidis to host cells[J].Curr Microbiol,2014,68(5):621-628.

[13]Shippy DC,Eakley NM,Mikheil DM,etal.Role of StdA in adhesion of Salmonella enterica serovar Enteritidis phage type 8 to host intestinal epithelial cells[J].Gut Pathog,2013,5(1):43.

[14]Zhu C,Meng X,Duan X,etal.SEF14 fimbriae from Salmonella enteritidis play a role in pathogenitic to cell model in vitro and host in vivo[J].Microb Pathog,2013,64(11):18-22.

[15]Xiong K,Chen Z,Xiang G,etal.Deletion of yncD gene in Salmonella enterica ssp.enterica serovar Typhi leads to attenuation in mouse model[J].FEMS Microbiol Lett,2012,328(1):70-77.

[16]Pang E,Tien-Lin C,Selvaraj M,etal.Deletion of the aceE gene (encoding a component of pyruvate dehydrogenase) attenuates Salmonella enterica serovar Enteritidis[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2011,63(1):108-118.

[17]Dong H,Peng D,Jiao X,etal.Roles of the spiA gene from Salmonella enteritidis in biofilm formation and virulence[J].Microbiology,2011,157(Pt 6):1798-1805.

[18]董洪燕，彭大新，焦新安，等.五株基因缺失的腸炎沙門菌免疫原性的研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2014,44(1):14-20.

[19]董洪燕，彭大新，焦新安，等.腸炎沙門氏菌雞源株ompR基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性與親本株的比較[J].微生物學(xué)報,2011,51(09):1256-1262.

[20]Paterson GK,Cone DB,Northen H,etal.Deletion of the gene encoding the glycolytic enzyme triosephosphate isomerase (tpi) alters morphology of Salmonella enterica serovar Typhimurium and decreases fitness in mice[J].FEMS Microbiol Lett,2009,294(1):45-51.

[21]耿士忠，劉男男，焦新安，等.雞白痢沙門菌S06004ΔspiC突變株的構(gòu)建與鑒定[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2014,44(04):379-386.

[22]趙戰(zhàn)勤，王臣，丁軻，等.表達T～+Pm保護性抗原的重組豬霍亂沙門氏菌C500株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性[J].微生物學(xué)報,2010,50(1):91-97.

[23]Zhao Z,Xue Y,Wu B,etal.Subcutaneous vaccination with attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis C500 expressing recombinant filamentous hemagglutinin and pertactin antigens protects mice against fatal infections with both S.enterica serovar Choleraesuis and Bordetella bronchiseptica[J].Infect Immun,2008,76(5):2157-2163.

[24]Matsuda K,Chaudhari AA,Lee JH.Evaluation of safety and protection efficacy on cpxR and lon deleted mutant of Salmonella Gallinarum as a live vaccine candidate for fowl typhoid[J].Vaccine,2011,29(4):668-674.

[收稿2015-07-20修回2015-08-04]

(編輯倪鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.036

S852.612文獻標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1241-04

陳松彪(1990年-)，男，碩士，主要從事人畜共患病的診斷和防治的研究，E-mail:chensongbiao@126.com。

及指導(dǎo)教師：張春杰(1964年-)，女，博士，教授，主要從事動物疫病防控和分子免疫學(xué)方面的研究，E-mail:cjzhang@sina.com。