李　芳，王杰瓊，宋春紅，魏　盛，張惠云，喬明琦

(1．北京市豐臺婦幼保健院藥劑科，北京　100069;2．山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南　250355)

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柴胡提取物對PMS肝氣郁證模型大鼠額葉5-HT3A/3BR分布與蛋白表達(dá)的影響

李芳1，王杰瓊2，宋春紅2，魏盛2，張惠云2，喬明琦2

(1．北京市豐臺婦幼保健院藥劑科，北京100069;2．山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250355)

中國圖書分類號: R-332; R284．1; R256．49; R322．81; R363-332; R392．11; R711．51

關(guān)鍵詞:柴胡提取物;經(jīng)前期綜合征;肝氣郁證;額葉; 5-HT3AR; 5-HT3BR;蛋白表達(dá)

喬明琦( 1955－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:肝藏象生理病理與情志致病機(jī)制，通訊作者，E-mail: qmingqi@163．com

Effects of Bupleurum extract on distribution and expression of 5-HT3A/3BR in frontal cortex of premenstrual syndrome model rats with liver-qi depression

LI Fang1，WANG Jie-qiong2，SONG Chun-hong2，WEI Sheng2，ZHANG Hui-yun2，QIAO Ming-qi2
( 1．Pharmacy Dept，F(xiàn)engtai Maternal＆Children's Health Hospital of Beijing，Beijing100069，China; 2．Key Laboratory for Classical Theory of Traditional Chinese Medicine of Education Ministry，Shangdong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Key words:Bupleurum extracts; premenstrual syndrome; liverqi depression; frontal cortex; 5-HT3AR; 5-HT3BR; protein expression

經(jīng)前期綜合征肝氣郁證( premenstrual syndrome，PMS)癥狀表現(xiàn)類似于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的抑郁樣情緒改變，前期研究證明PMS肝氣郁證的發(fā)生與腦內(nèi)5-HT系統(tǒng)及其受體密切相關(guān)［1］，柴胡提取物通過不同分子機(jī)制干預(yù)PMS肝氣郁證的抑郁情緒［2－3］。但是柴胡提取物在5-HT3R水平對PMS肝氣郁證經(jīng)前抑郁情緒的干預(yù)機(jī)制尚未見報道，因此，本實(shí)驗(yàn)選取PMS肝氣郁證為動物模型初步探討柴胡提取物調(diào)控抑郁情緒的微觀作用機(jī)制。

1　材料

1．1實(shí)驗(yàn)動物Wistar大鼠，體質(zhì)量( 180～200) g，♀，由山東中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號: SCXK(魯) 2011－0003。

1．2藥品與主要試劑柴胡提取物(青島陽光海川醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號: 20110526) ; Anti-5-HT3Areceptor antibody ( ab51950)，Anti-HTR3B( MFG40388)，5-HT3A二抗( Abcam，ab-16248)，5-HT3B二抗( sc-2020)。

2　方法

2．1PMS肝氣郁證大鼠模型制備及取材根據(jù)文獻(xiàn)方法選取大鼠(隨機(jī)分為3組，每組12只)并復(fù)制PMS肝氣郁證模型［3］，連續(xù)造模5 d，治療組大鼠造模同時灌胃柴胡提取物( 0. 32 g·kg－1)，正常對照組和模型組各給予相同體積的生理鹽水。將每組6只大鼠用多聚甲醛心臟灌流，取前額葉，石蠟包被，切片，用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)。每組另外6只大鼠，于冰塊上剝離額葉，放于－80℃冰箱，Western blot實(shí)驗(yàn)備用。

2．2免疫熒光雙標(biāo)記法檢測大鼠額葉5-HT3A/3BR分布石蠟切片常規(guī)脫蠟，抗原熱修復(fù)，封閉，結(jié)合一抗( 1∶400)，復(fù)溫、洗滌，結(jié)合二抗( 1∶500)，洗滌，滴加甘油，封片。置激光共聚焦顯微鏡下觀察5-HT3AR、5-HT3BR在額葉的分布及同位點(diǎn)表達(dá)情況。

2．3Western blot方法檢測大鼠額葉5-HT3A/3BR蛋白表達(dá)

以50μg額葉總蛋白每泳道上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉。與一抗( anti-5-HT3B1∶400，anti-5-HT3A1∶400)和β-actin ( 1∶1 500)抗體孵育，洗滌，結(jié)合各自相應(yīng)二抗( anti-5-HT3A1∶400，anti-5-HT3B1∶400)孵育，洗滌，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測雜交信號。

2．4統(tǒng)計學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因變量多因素方差分析。

3　結(jié)果

3．1各組大鼠額葉5-HT3A/3BR的定位分布各組大鼠額葉5-HT3AR和5-HT3BR陽性細(xì)胞共表達(dá)呈黃色，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，額區(qū)陽性細(xì)胞均有分布，且多分布于細(xì)胞膜，細(xì)胞形態(tài)多為點(diǎn)狀或圓狀。

3．2各組大鼠額葉5-HT3AR蛋白表達(dá)與正常組相比，模型組額葉5-HT3AR蛋白表達(dá)明顯升高( P＜0. 05) ;與模型組相比，柴胡提取物組5-HT3AR蛋白表達(dá)明顯降低( P＜0. 05)。

3．3各組大鼠額葉5-HT3BR蛋白表達(dá)與正常組相比，模型組額葉5-HT3BR蛋白表達(dá)明顯升高( P＜0. 05) ;與模型組相比，柴胡提取物組5-HT3BR蛋白表達(dá)降低( P＜0. 05)。

4　討論

文獻(xiàn)報道5-HT3AR和5-HT3BR為5-HT3R最主要的兩個受體亞型，且5-HT3AR為5-HT3R離子通道的功能性受體［4］，因此，本實(shí)驗(yàn)以大鼠額葉5-HT3A和5-HT3BR作為研究對象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PMS肝氣郁證模型組大鼠額葉5-HT3AR和5-HT3BR蛋白表達(dá)均明顯升高，柴胡提取物干預(yù)后其蛋白表達(dá)明顯降低，由此推測PMS肝氣郁證模型抑郁情緒的發(fā)生可能與5-HT3AR和5-HT3BR蛋白上調(diào)有關(guān)，柴胡提取物通過下調(diào)額葉5-HT3AR、5-HT3BR蛋白表達(dá)發(fā)揮其抗抑郁樣情緒的作用。在下一步的工作中需要繼續(xù)尋找柴胡發(fā)揮其抗抑郁樣作用與5-HT3R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的關(guān)系，以期望更進(jìn)一步探索PMS的發(fā)病機(jī)制及柴胡提取物干預(yù)PMS肝氣郁證經(jīng)前抑郁情緒的藥理作用機(jī)制。

(致謝:本文實(shí)驗(yàn)在山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此深表感謝! )

參考文獻(xiàn):

［1］李芳，香秋梅，宋春紅，等．經(jīng)前期綜合征相關(guān)性5-羥色胺系統(tǒng)的研究進(jìn)展［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2014，20( 22) : 4048－50．

［1］Li F，Xiang Q M，Song C H，et al．The study of premenstrual syndromes associated 5-serotonin system［J］．Med Recapitul，2014，20 ( 22) : 4048－50．

［2］宋春紅，李芳，郭英慧，等．舒郁膠囊及主要組份對PMS肝氣郁證大鼠海馬中CACNA1C蛋白表達(dá)和功能的影響［J］．中國藥理學(xué)通報，2014，30( 10) : 1476－7．

［2］Song C H，Li F，Guo Y H，et al．Effects of Shuyu capsule and its main composition on protein expression and function of CACNA1C in hippocampus of rat with PMS liver-qi stagnation［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30( 10) : 1476－7．

［3］Gao X X，Sun P，Qiao M Q，et al．Shu-Yu capsule，a Traditional Chinese Medicine formulation，attenuates premenstrual syndrome depression induced by chronic stress constraint［J］．Mol Med Rep，2014，10( 6) : 2942－8．

［4］Lummis S C．5-HT3receptors［J］．J Biol Chem，2012，287( 48) : 40239－45．

作者簡介:李芳( 1980－)，女，博士，主管中藥師，研究方向:中藥調(diào)肝方藥藥理學(xué)，Tel: 010-83917191，E-mail: lifanghappy163@163．com;

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助課題( No 81173163，81173151)

收稿日期:2015－09－01，修回日期: 2015－11－12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0146－02

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．031