張另沾，劉　樂，文　曙，趙鐵華

( 1．河北師范大學藥物研究所，河北石家莊　050024;2．懷化市第一人民醫(yī)院檢驗科，湖南懷化　418000)

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［D-Ala2，D-Ala5］-腦啡肽及其聚乙二醇修飾對熱板致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用

張另沾1，劉樂1，文曙2，趙鐵華1

( 1．河北師范大學藥物研究所，河北石家莊050024;2．懷化市第一人民醫(yī)院檢驗科，湖南懷化418000)

中國圖書分類號: R-332; R341. 6; R971. 1; R977. 6

關鍵詞:腦啡肽;［D-Ala2，D-Ala5］-腦啡肽;聚乙二醇;化學修飾;鎮(zhèn)痛;小鼠

趙鐵華( 1957－)，男，碩士，教授，研究方向:多肽設計合成，通訊作者，Tel: 0311-80787425，E-mail: zhaotiehua @ ______163．com

Analgesic activity of［D-Ala2，D-Ala5］-enkephalin and its pegylation to painful mice induced by hot plate

ZHANG Ling-zhan1，LIU le1，WEN Shu2，ZHAO Tiehua1
( 1．Institute of Materia Medica，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China; 2．Dept of Laboratory Medicine，NO．1 Hospital of Huaihuay，Huaihua，Hunan 418000，China)

Key words:enkephalin ( ENK) ;［D-Ala2，D-Ala5］-ENK; polyethylene glycol ( PEG) ; conjugation; analgesia; mice

我們曾經報告，相對分子質量2 ku、5 ku 直鏈甲氧基聚乙二醇( mPEG)修飾的腦啡肽( Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，ENK)半衰期延長、清除率下降、鎮(zhèn)痛藥效增強［1］。在此基礎上，本文對D-Ala替換ENK第2、5位氨基酸(［D-Ala2，D-Ala5］-ENK，DADAE)、及其5 ku分子質量mPEG修飾雙重結構改造的合成腦啡肽類似物進行了鎮(zhèn)痛藥效分析。

1　材料與方法

1．1受試化合物化合物A: ENK-Cys-NH2、化合物B: DADAE-Cys-NH2、化合物C: DADAE-Cys( mPEG5000-MAL) -NH2為本實驗室采用Fmoc固相法合成，RP-HPLC純化，質量分數(shù)大于0. 95; MS鑒定:化合物A、B分子質量為677 u和631 u，化合物C在5 662 u附近有一組相差44的峰，與預期相符;生理鹽水( NS)溶解，0. 45 μm濾膜濾過。嗎啡( Mor)為東北第六制藥廠生產，批號001009; NS稀釋。

1．2儀器智能熱板儀: RB-200型，成都泰盟產品。

1．3動物分組及給藥KM小鼠，♀，體質量18～22 g［中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所繁育場，合格證號SCXK(京) 2004－0001］。按側腦室和尾靜脈途徑，分層隨機方法分為NS和Mor對照，及化合物A、B、C試驗組，每組10只以上;側腦室給藥［1］按3. 1 μmol·kg－1( 0. 2 mL·kg－1)、尾靜脈給藥按31 μmol·kg－1( 20 mL·kg－1)條件注射受試及對照藥，NS組注射相同體質量容積NS。

1．4熱板鎮(zhèn)痛試驗［1］20℃±1℃室溫條件，置小鼠于55℃±0. 5℃熱板，以接觸熱板至舔后足所經歷時間為痛閾值;剔除痛閾值小于3 s和大于30 s小鼠;觀察記錄時間點為給藥前和給藥后15、30、60、120 min。

Tab 1 Effects of［D-Ala2，D-Ala5］-ENK and mPEG5000modified［D-Ala2，D-Ala5］-ENK to painful mice induced by hot plate through icv(±s)

Tab 1 Effects of［D-Ala2，D-Ala5］-ENK and mPEG5000modified［D-Ala2，D-Ala5］-ENK to painful mice induced by hot plate through icv(±s)

DADAE-Cys-NH2:［D-Ala2，D-Ala5］-ENK，DADAE-PEG: mPEG5000modified DADAE-Cys-NH2．Dose: 3．1 μmol·kg－1，volume: 0. 2 ml· kg－1．*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs NS;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs DADAE-PEG．

Group　n　Pain threshold/difference with pre-adminis After 60 min　After 120 min NS　12　16．74±4．66　17．53±8．76 0．79±8．22 tration/s Pre-admin-istration　After 15 min　After 30 min 3．82±7．80 Mor　10　16．17±4．03　51．23±15．51 35．07±15．96＊＊18．71±7．38 1．97±6．72 23．68±7．12 6．93±7．01 20．56±8．39 32．41±15．41 16．09±15．79*ENK-Cys-NH2　9　17．02±3．60　25．35±13．87 8．33±15．90##45．02±21．87 28．86±22．77＊＊43．26±16．4027．09±16．37＊＊23．74±9．56 6．22±10．57#DADAE-Cys-NH2　7　13．09±2．78　37．36±21．48 24．27±20．54*23．02±6．97 6．00±7．17##20．41±8．06 3．33±7．88##28．53±18．65 15．44±18．08 DADAE-PEG　7　16．83±4．84　53．46±17．31 __________________________________________36．63±16．84＊＊33．68±24．86 20．58±23．73 30．81±20．47 17．72±20．76 53．89±16．12 37．06±15．71＊＊52．35±20．25 35．51±19．66＊＊43．36±25．03 28．52±21．80*

Tab 2 Effects of［D-Ala2，D-Ala5］-ENK and mPEG5000modified［D-Ala2，D-Ala5］-ENK to painful mice induced by hot plate through iv(±s)

Tab 2 Effects of［D-Ala2，D-Ala5］-ENK and mPEG5000modified［D-Ala2，D-Ala5］-ENK to painful mice induced by hot plate through iv(±s)

Dose: 31 μmol·kg－1，volume: 20 mL·kg－1．

Group　n　Pain threshold/difference with pre-adminis After 60 min　After 120 min NS　12　13．33±4．13　12．23±4．71 －1．10±6．91 tration/s Pre-admin-istration　After 15 min　After 30 min 6．51±10．75 Mor　12　15．54±3．99　38．15±18．41 22．61±17．40＊＊15．16±5．81 1．83±4．56 16．94±10．27 3．62±7．98 19．84±13．43 19．25±6．35 3．42±6．27#ENK-Cys-NH2　8　12．31±4．22　18．86±5．54 6．54±4．09＊＊#52．83±12．88 37．30±12．30＊＊29．53±18．87 14．00±17．77 13．33±6．66 1．01±5．12#DADAE-Cys-NH2　8　14．46±6．42　24．24±6．02 9．77±5．19＊＊18．17±7．57 5．86±5．17 18．94±9．82 6．63±6．60 20．26±14．76 5．80±12．55 DADAE-PEG　8　14．97±4．70　37．44±14．95 __________________________________________22．47±16．58＊＊26．80±16．48 12．33±13．59*21．87±8．08 7．40±5．18 35．08±19．36 20．11±21．07*27．55±17．54 12．58±18．47________ 36．35±21．00 21．38±20．31______

2　結果

mPEG5000修飾DADAE側腦室給藥120 min內、尾靜脈30 min內痛閾值明顯增高表現(xiàn)與對照藥嗎啡相同，與NS組比較P＜0. 05;并且2個途徑給藥增高痛閾值大于DADAECys-NH2和ENK-Cys-NH2，側腦室給藥時大于嗎啡;其中與ENK-Cys-NH2比較，2途徑15 min、靜脈120 min時P＜0. 05，見Tab 1，2。

3　討論

已知ENK序列中Tyr和3位Gly、4位Phe為活性必需殘基［2］，采用非天然結構的D型氨基酸替換非必須氨基酸可提高ENK酶解穩(wěn)定性，并且適宜分子質量聚乙二醇修飾有利于穩(wěn)定ENK結構、改善其通過血腦屏障的能力［3－4］。參考以上原則，本文合成ENK類似物［D-Ala2，D-Ala5］-ENK( DADAE)，采用Cys巰基修飾方法對合成產物進行5ku分子質量mPEG的C端定點修飾［5］，并以測試中樞鎮(zhèn)痛藥效的小鼠熱板致痛模型［6］進行活性分析。實驗結果，合成產物鎮(zhèn)痛活性和維持時間的表現(xiàn)是: mPEG5000修飾DADAE＞DADAE＞ENK，并且mPEG5000修飾DADAE鎮(zhèn)痛作用有優(yōu)于等劑量嗎啡的趨勢。本文實驗結果與Arizona大學的類似研究結論［3－4］一致，對改善ENK及其類似物的成藥性具有積極意義(側腦室NS、Mor、ENK-Cys-NH2組數(shù)據(jù)已見參考文獻1，本文因同批次試驗數(shù)據(jù)分析需要列出)。

參考文獻:

［1］趙鐵華，文曙，鄧淑華，等．聚乙二醇化腦啡肽的鎮(zhèn)痛藥效和體內分布［J］．中國藥理學通報，2013，29( 5) : 703－7．

［1］Zhao T H，Wen S，Deng S H，et al．Analgesic activity and biodistribution of polyethylene glycol conjugation to enkephalin［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29( 5) : 703－7．

［2］計明娟，葉學其，楊鵬程．甲硫氨酸－腦啡肽的分子動力學模擬［J］．物理化學學報，1999，15 ( 11) : 1011－6．

［2］Ji M J，Ye X Q，Yang P C．Molec dynamics simulations for Metenkephalin［J］．Acta physico-Chim Sin，1999，15 ( 11) : 1011－6．

［3］Witt K A，Davis T P．CNS drug delivery: Opioid peptides and the blood-brain barrier［J］．Open Informat Sci J，2006，8( 1) : E76 －88．

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［5］Yu P Z，Zheng C Y，Chen J，et al．Investigation on PEGylation strategy of recombinant human interleukin-1 receptor antagonist ［J］．Bioorg Med Chem，2007，15( 16) : 5396－405．

［6］洪庚辛．鎮(zhèn)痛藥研究方法學［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2009: 313－5．

［6］Hong G X．Research methodology of analgesic drugs［M］．Beijing: People’s Medical Publishing House，2009: 313－5．

作者簡介:張另沾( 1988－)，女，碩士生，研究方向:肽類藥物合成和評價，Tel: 0311-80787425，E-mail: 1242308368@ qq．com;

基金項目:河北省自然科學基金資助項目( No C2005000681)

收稿日期:2015－09－05，修回日期: 2015－11－20

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0147－02

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．032