黃　毅，　邱福南，　陳敦雁，　伍嚴(yán)安，　李　峰，　黃肖利，　吳文冰

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 1檢驗(yàn)科， 2肝膽外科， 3病理科，福建 福州 350001)

?

eEF1A2在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的表達(dá)*

黃毅1△，邱福南2，陳敦雁1，伍嚴(yán)安1，李峰3，黃肖利1，吳文冰1

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院1檢驗(yàn)科，2肝膽外科，3病理科，福建 福州 350001)

[摘要]目的： 研究真核翻譯延長(zhǎng)因子1A2(eEF1A2)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)組織的表達(dá)，以及eEF1A2過(guò)表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法: 應(yīng)用real-time PCR法和免疫組化法分別檢測(cè)62例HCC癌組織與配對(duì)癌旁組織、20例正常肝臟組織eEF1A2的mRNA和蛋白表達(dá)，應(yīng)用real-time PCR法與Western blot法分別檢測(cè)幾種HCC細(xì)胞株eEF1A2的mRNA與蛋白表達(dá)。構(gòu)建GV287-eEF1A2表達(dá)慢病毒感染低表達(dá)eEF1A2的HCC細(xì)胞，應(yīng)用real-time PCR法和Western blot法分別檢測(cè)細(xì)胞eEF1A2 的mRNA和蛋白表達(dá)；應(yīng)用MTT法、DNA倍體法和real-time PCR法分別檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和白蛋白mRNA的表達(dá)。結(jié)果: HCC癌組織eEF1A2的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于配對(duì)癌旁組織與正常肝臟組織(P<0.01)；eEF1A2的mRNA和蛋白在HCC細(xì)胞株SMMC-7721和BEL-7402高表達(dá)，在SK-HEP-1低表達(dá)。構(gòu)建的GV287-eEF1A2表達(dá)慢病毒可感染SK-HEP-1細(xì)胞使eEF1A2過(guò)表達(dá)；與陰性對(duì)照組相比，GV287-eEF1A2組SK-HEP-1細(xì)胞的活力升高，白蛋白的mRNA表達(dá)水平降低，G0/G1期的細(xì)胞比例顯著減少，而S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著升高。結(jié)論: eEF1A2在HCC癌組織存在異位高表達(dá)；eEF1A2可能是HCC的一種潛在癌蛋白，其過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)HCC細(xì)胞的增殖能力，降低HCC細(xì)胞的分化程度，并促使細(xì)胞周期通過(guò)G0/G1期，進(jìn)入S期和G2/M期。

[關(guān)鍵詞]真核翻譯延長(zhǎng)因子1A2； 肝細(xì)胞癌； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞周期

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)常見的惡性腫瘤，全世界每年發(fā)生50萬(wàn)例HCC中一半以上在中國(guó)，其相關(guān)致癌機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外研究的難點(diǎn)。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)腫瘤的研究多集中在癌基因突變、活化、抑癌基因失活及轉(zhuǎn)錄因子異常等方面，而相對(duì)忽略與蛋白質(zhì)合成進(jìn)程相關(guān)蛋白的致癌作用[1]。人類真核翻譯延長(zhǎng)因子1A2(eukaryotic elongation factor 1A2，eEF1A2)參與蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程肽鏈的延長(zhǎng)，傳統(tǒng)觀念被認(rèn)為是一種管家蛋白。相比其異構(gòu)體eEF1A1，eEF1A2表達(dá)具有組織特異性，只局限于心臟、腦和骨骼肌。但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，eEF1A2在多種其它組織來(lái)源的腫瘤中存在著異位高表達(dá)[2-7]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在觀察eEF1A2在HCC組織與細(xì)胞株的表達(dá)情況，并構(gòu)建有效表達(dá)eEF1A2的慢病毒，探討eEF1A2過(guò)表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響。

材料和方法

1研究對(duì)象

收集2012年10月～2013年12月期間在福建省立醫(yī)院接受手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的HCC患者62例，其中男性52例，女性10例，年齡(54.3±12.2)歲(18～73歲)。所有患者術(shù)前均未行放、化治療。分別取每位患者手術(shù)切除的肝癌組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，標(biāo)本切除后部分置4%甲醛固定，備用免疫組化法檢測(cè)；部分置RNA保存液浸泡過(guò)夜，然后置于-80 ℃低溫冰箱保存，備用real-time PCR法檢測(cè)。正常肝臟組織對(duì)照來(lái)自2012年10月～2013年12月期間在福建省立醫(yī)院接受手術(shù)切除的20例肝臟血管瘤患者，其中男性12例，女性8例，年齡(40.8±10.4)歲(25～66歲)。所有患者均排除肝炎與肝硬化。取患者手術(shù)切除的肝臟血管瘤周邊組織標(biāo)本，處理方式同肝癌組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本。

2細(xì)胞培養(yǎng)

人HCC細(xì)胞株SMMC-7721、BEL-7402和SK-HEP-1購(gòu)自中科院細(xì)胞所，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(Gibco)，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次；實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1Real-time PCR法檢測(cè)HCC肝臟癌組織標(biāo)本與細(xì)胞株eEF1A2的 mRNA表達(dá)用TRIzol試劑(Invitrogen)提取經(jīng)充分研磨的62例HCC肝臟癌組織和配對(duì)癌旁組織、20例正常肝臟組織標(biāo)本以及處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCC細(xì)胞株SMMC-7721、BEL-7402和SK-HEP-1的總RNA，并對(duì)其進(jìn)行DNase 處理后，分別取2 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以SYBR GreenⅠ(ABI)為熒光染料，在real-time PCR儀(ABI 7300)上分別行eEF1A2和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因的擴(kuò)增。eEF1A2的上游引物為5’-GTCAAGGAAGTCAGCGCCTAC-3’，下游引物為5’-TGAACCACGGCATGTTGGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為124 bp；GAPDH的上游引物為5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物為5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為121 bp。Real-time PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物均經(jīng)熔解曲線分析驗(yàn)證特異性，熔解曲線分析條件為95 ℃ 1 min，20 ℃/s；55 ℃ 1 min，20 ℃/s；55～95 ℃，0.5 ℃/s。以GAPDH為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCt法比較各組eEF1A2 的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3.2免疫組化法檢測(cè)HCC肝臟癌組織標(biāo)本eEF1A2 蛋白的表達(dá)62例HCC肝臟癌組織和配對(duì)癌旁組織、20例正常肝臟組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定后，制作成石蠟切片，采用免疫組化SP法染色(試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司)，用1∶50稀釋的兔抗人eEF1A2多克隆抗體(Novusbio)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，高倍鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，染色細(xì)胞≥10%為陽(yáng)性，<10%為陰性。

3.3Western blot法檢測(cè)HCC細(xì)胞株eEF1A2蛋白的表達(dá)按1×105∶1的比例加入細(xì)胞裂解液提取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCC細(xì)胞株SK-HEP-1的總蛋白，經(jīng)紫外分光光度計(jì)(Beckman DU640)測(cè)定含量后，分別取等量總蛋白99 ℃變性5 min，進(jìn)行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜上；封閉NC膜1 h，加入相應(yīng)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，其中GAPDH兔抗購(gòu)自CST，eEF1A2兔抗購(gòu)自Novusbio；TBS洗滌后，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(KPL)，室溫孵育1 h；TBS洗滌后加LumiGLO Chemiluminescent Substrate(KPL)室溫下孵育1 min，曝光，洗片，然后在GelDoc凝膠圖像分析儀(Bio-Rad)上掃描條帶的灰度，并以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算eEF1A2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3.4構(gòu)建eEF1A2表達(dá)慢病毒(1)eEF1A2表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的eEF1A2基因(NM_001958)編碼序列，設(shè)計(jì)出含交換配對(duì)堿基和酶切位點(diǎn)，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR釣取目的基因的一對(duì)引物，正向引物為 5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGC-AAGGAGAAGACCCAC-3’，反向引物為5’-TCCTTGTAGTCCATACCCTTGCCCGCCTTCTGCGCCTT CTGC-GCCGACTTG-3’。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將得到的PCR產(chǎn)物(1.43 kb)交換入線性化表達(dá)載體GV287(AgeI/AgeI酶切，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)中，構(gòu)建重組的GV287-eEF1A2慢病毒表達(dá)載體，預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物為50 kD的eEF1A2蛋白，然后以線性環(huán)化的空載體作為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Dpα，挑取重組陽(yáng)性菌落行PCR 及測(cè)序鑒定。(2)慢病毒包裝：通過(guò)Lipofectamine 2000(Invitrogen)將構(gòu)建的重組慢病毒表達(dá)載體和相對(duì)應(yīng)的包裝質(zhì)粒pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，48 h后收集上清液，濃縮，測(cè)定慢病毒的滴度，分裝，-80oC保存?zhèn)溆谩?3)細(xì)胞感染及實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)預(yù)先摸索的MOI值，將獲得的慢病毒感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-HEP-1細(xì)胞，12 h后吸去含病毒和聚凝胺(polybrene)的上清液，加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，感染3 d后在熒光顯微鏡下觀察慢病毒上報(bào)告基因GFP 的表達(dá)情況，感染效率大于80%者繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3組，分別為：過(guò)表達(dá)組(over-expression，OE)組，感染GV287-eEF1A2表達(dá)慢病毒；陰性對(duì)照(negative control，NC)組，感染GV287空載體；空白對(duì)照(control，CON)組，未感染慢病毒。(4)GV287-eEF1A2表達(dá)慢病毒功能鑒定：慢病毒感染5 d后，收集各組細(xì)胞分別提取RNA和總蛋白，采用real-time PCR法檢測(cè)eEF1A2的 mRNA，Western blot法檢測(cè)eEF1A2的蛋白，觀察GV287-eEF1A2表達(dá)慢病毒在SK-HEP-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)eEF1A2的效果。

3.5MTT法繪制細(xì)胞活力曲線收集感染效率大于80% 的SK-HEP-1細(xì)胞并接種于96孔板，每孔100 μL，每孔接種細(xì)胞數(shù)為2×103，實(shí)驗(yàn)設(shè)OE組、NC組和CON組，每組3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)5 d；實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入5 g/L的MTT(Sigma)10 μL，37 ℃孵育4 h后小心吸去上清，加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，置酶標(biāo)儀(Stat Fax-2100)上振蕩溶解結(jié)晶后用490 nm波長(zhǎng)比色，以吸光度A值為縱軸，作用時(shí)間為橫軸繪制SK-HEP-1細(xì)胞活力變化曲線。

3.6白蛋白(albumin)mRNA表達(dá)的檢測(cè)慢病毒感染5 d后，分別收集OE組、NC組和CON組SK-HEP-1細(xì)胞，采用real-time PCR法檢測(cè)白蛋白的mRNA。白蛋白的上游引物為5’-TGCAACTCTTCGTGAAACCTATG-3’，下游引物為5’-ACATCAACCTCTGGTCTCACC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為135 bp。Real-time PCR的反應(yīng)條件及擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法見3.1。

3.7 細(xì)胞周期的檢測(cè)慢病毒感染5 d后，分別收集OE組、NC組和CON組SK-HEP-1細(xì)胞，PBS洗滌；加入4 ℃預(yù)冷的70% 乙醇固定細(xì)胞至少1 h，1 500 r/min 離心5 min去除固定液，PBS洗滌細(xì)胞沉淀1次；按DNA倍體檢測(cè)試劑盒(Sigma)說(shuō)明加入碘化丙碇溶液，避光作用15 min，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞分析儀(BD)上檢測(cè)細(xì)胞周期情況,每次至少計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，對(duì)符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)，多組間均值的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)，兩組間均值的比較采用SNK-q檢驗(yàn)；對(duì)不符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)，組間的比較采用Nonparametric Tests的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均在SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包上進(jìn)行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1HCC肝臟癌組織eEF1A2的表達(dá)

以real-time PCR法檢測(cè)62例HCC肝臟癌組織與配對(duì)癌旁組織、20例正常肝臟組織的eEF1A2的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示癌組織eEF1A2的mRNA表達(dá)量的中位數(shù)為35.27，明顯高于配對(duì)癌旁組織和正常肝臟組織(P<0.01)，見圖1。免疫組化染色結(jié)果顯示eEF1A2的陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞質(zhì)(圖2)。62例HCC癌組織有47例呈eEF1A2陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率達(dá)75.8%；62例配對(duì)癌旁組織僅5例呈eEF1A2弱陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為8.1%，20例正常肝臟組織無(wú)一例eEF1A2陽(yáng)性。HCC癌組織的eEF1A2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于配對(duì)癌旁組織與正常肝臟組織(P<0.01)。

Figure 1.The mRNA expression of eEF1A2 in the HCC tissues and cells detected by real-time PCR. The mRNA of GAPDH was used as an internal control. The expression data was plotted as 2-ΔΔCtrelative to normal liver tissues. A: the relative mRNA expression level of eEF1A2 in the HCC tissues; B: the relative mRNA expression level of eEF1A2 in the HCC cells. Mean±SD.**P<0.01vsHCC;##P<0.01vsnormal liver tissues and SK-HEP-1.

圖1HCC肝臟癌組織與細(xì)胞eEF1A2 mRNA的表達(dá)

Figure 2.The protein expression of eEF1A2 in the HCC tissue and matched liver tissue from an HCC patient, and normal liver tissue analyzed by immunohistochemical staining (SP，×200).

圖2HCC患者癌組織、配對(duì)肝臟組織及正常肝臟組織eEF1A2蛋白的表達(dá)

2HCC細(xì)胞株eEF1A2的表達(dá)

Real-time PCR法與Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示eEF1A2的mRNA和蛋白在HCC細(xì)胞株SMMC-7721和BEL-7402中存在明顯高表達(dá)，且以BEL-7402細(xì)胞的表達(dá)量最高；在HCC細(xì)胞株SK-HEP-1中則呈低表達(dá)，見圖1、3。

3GV287-eEF1A2表達(dá)慢病毒在SK-HEP-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)eEF1A2的效果

構(gòu)建GV287-eEF1A2表達(dá)慢病毒感染SK-HEP-1細(xì)胞，使eEF1A2過(guò)表達(dá)，與NC組相比較，OE組細(xì)胞eEF1A2的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別升高了88.3%和69.2%，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

4eEF1A2過(guò)表達(dá)對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞活力的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，OE組、NC組和CON組SK-HEP-1細(xì)胞的細(xì)胞活力在培養(yǎng)的第2天開始增加，第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)曲線良好；相比NC組，OE組細(xì)胞活力增加趨勢(shì)更為明顯，在培養(yǎng)第5天的細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)，見圖5。

Figure 3.The protein expression of eEF1A2 in the HCC cells. GAPDH protein was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsBEL-7402 and SMMC-7721.

圖3HCC細(xì)胞eEF1A2蛋白的表達(dá)

Figure 4.The effect of GV287-eEF1A2 on the expression of eEF1A2 in SK-HEP-1 cells. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC and CON.

圖4GV287-eEF1A2對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞eEF1A2表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of GV287-eEF1A2 on the activity of SK-HEP-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC and CON.

圖5GV287-eEF1A2對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞活力的影響

5eEF1A2過(guò)表達(dá)對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞白蛋白mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，OE組細(xì)胞的白蛋白mRNA呈低表達(dá)，與NC組相比較其表達(dá)水平減低了53.5%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖6。

Figure 6.The effect of GV287-eEF1A2 on the mRNA expression of albumin in the SK-HEP-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC and CON.

圖6GV287-eEF1A2對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞白蛋白mRNA表達(dá)的影響

6eEF1A2過(guò)表達(dá)對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞周期的影響

DNA倍體法檢測(cè)結(jié)果顯示慢病毒感染后，OE組處于G0/G1期的SK-HEP-1細(xì)胞比例為(38.17±1.49)%，明顯低于NC組的(62.37±2.06)%(P<0.01)；而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例升高，與NC組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖7。

討論

eEF1A能與GTP、氨基酰-tRNA形成3聚體，再與核糖體結(jié)合，傳送氨基酸-tRNA入A位，使肽鏈延長(zhǎng)，保證蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和速度。eEF1A有2個(gè)異構(gòu)體，分別為eEF1A1與eEF1A2，兩者序列同源性大于90%，而且功能相同；但在哺乳動(dòng)物中，兩者的表達(dá)模式存在明顯差異：eEF1A1在體內(nèi)組織中廣泛表達(dá)，而eEF1A2的表達(dá)只限于心臟、腦和骨骼肌。研究表明除了翻譯延長(zhǎng)因子的基本功能外，eEF1A2在細(xì)胞中還發(fā)揮著其它多種作用，如促進(jìn)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞增殖、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，抑制衰老，并可通過(guò)與一些信號(hào)分子如磷脂酰肌醇-4-激酶、磷脂酶Cγ、鈣調(diào)蛋白的相互作用參與磷脂酰肌醇、鈣等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)[8]。這種多功能蛋白的特性使eEF1A2具有潛在的致癌作用，并在多種腫瘤中存在著異位高表達(dá)[2-7]。Anand等[2]最早提出eEF1A2可能在卵巢癌的發(fā)展過(guò)程中起重要作用。研究顯示eEF1A2在正常卵巢上皮細(xì)胞不表達(dá)，但1/3的卵巢腫瘤組織及細(xì)胞株中存在eEF1A2 mRNA的異位高表達(dá)。同時(shí)eEF1A2還具有誘導(dǎo)正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用，將外源性eEF1A2轉(zhuǎn)染入小鼠成纖維細(xì)胞NIpT3，表達(dá)eEF1A2的NIpT3細(xì)胞可在軟瓊脂糖中呈集落樣生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速率明顯大于對(duì)照組；另外，將高表達(dá)eEF1A2的NIpT3細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)，可引起移植瘤的形成。除卵巢癌外，eEF1A2的異常高表達(dá)被發(fā)現(xiàn)也見于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、消化道腫瘤中[3-7]。

Figure 7.The effect of GV287-eEF1A2 on the cell cycle of SK-HEP-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC and CON.

圖7GV287-eEF1A2對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞周期的影響

我們的研究結(jié)果顯示，eEF1A2的mRNA在HCC癌組織的表達(dá)量明顯高于配對(duì)癌旁組織與正常肝臟組織；其蛋白的免疫組化陽(yáng)性率高達(dá)75.8%，而配對(duì)的癌旁組織僅5例呈弱陽(yáng)性表達(dá)，正常肝臟組織無(wú)一例陽(yáng)性，提示eEF1A2在HCC組織存在著異位高表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道eEF1A2能與鋅指蛋白1結(jié)合，再通過(guò)與一組具有酪氨酸激酶活性的受體結(jié)合，將信號(hào)從胞漿傳到胞核，有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖[9]。此外，eEF1A2還可有效結(jié)合蛋白激酶B(Akt)，通過(guò)提高人乳腺癌BT-549細(xì)胞[10]與小鼠漿細(xì)胞瘤ABPC4細(xì)胞[11]內(nèi)Akt的磷酸化水平，促進(jìn)這些腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲性與遷移能力，增強(qiáng)細(xì)胞的惡性度。因此，eEF1A2在HCC的異位高表達(dá)是否參與HCC的發(fā)展值得探討。為篩選用于eEF1A2過(guò)表達(dá)研究的HCC工具細(xì)胞，本研究檢測(cè)了eEF1A2的mRNA和蛋白在幾種HCC細(xì)胞株的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相比SMMC-7721和BEL-7402細(xì)胞的高表達(dá)，SK-HEP-1細(xì)胞的eEF1A2表達(dá)量低，可作為一種理想的工具細(xì)胞。在此工作基礎(chǔ)上，我們以GV287為載體，構(gòu)建了GV287-eEF1A2重組表達(dá)慢病毒，通過(guò)real-time PCR及Western blot方法檢測(cè)顯示GV287-eEF1A2慢病毒在SK-HEP-1細(xì)胞內(nèi)可有效表達(dá)eEF1A2，表現(xiàn)為與NC組相比較，OE組細(xì)胞eEF1A2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別明顯升高了88.3%和69.2%。將該慢病毒感染SK-HEP-1細(xì)胞，MTT結(jié)果顯示SK-HEP-1細(xì)胞的活力增強(qiáng)，在培養(yǎng)第5天的細(xì)胞活力明顯高于NC組，結(jié)合細(xì)胞周期分析可認(rèn)為eEF1A2過(guò)表達(dá)能促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)eEF1A2的過(guò)表達(dá)還可明顯抑制HCC細(xì)胞合成白蛋白的能力，使其mRNA表達(dá)水平的減少高達(dá)53.5%，而合成白蛋白能力被認(rèn)為與肝臟細(xì)胞分化程度密切相關(guān)[12]，提示eEF1A2的過(guò)表達(dá)可能降低HCC細(xì)胞的分化程度，從而增加其惡性表型；對(duì)增殖能力增強(qiáng)以及白蛋白合成能力減低的HCC細(xì)胞行細(xì)胞周期分析，結(jié)果顯示GV287-eEF1A2的感染使G0/G1期的細(xì)胞比例顯著減少，而S期、G2/M期的細(xì)胞比例顯著升高。以上結(jié)果說(shuō)明eEF1A2的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)HCC細(xì)胞的增殖能力，降低HCC細(xì)胞的分化程度，并促使細(xì)胞周期通過(guò)G0/G1期、進(jìn)入S期和G2/M期，提示eEF1A2可能參與了HCC疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。細(xì)胞的增殖、分化及周期調(diào)控異常是腫瘤形成的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，我們認(rèn)為在HCC異位高表達(dá)的eEF1A2可能是HCC的一種潛在癌蛋白，其致癌作用與機(jī)制可能是多方面的，除了本身對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)節(jié)外，eEF1A2在HCC細(xì)胞是否還參與Akt等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，以及eEF1A2表達(dá)對(duì)凋亡、遷移、侵襲等其它腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，有待本研究后續(xù)探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Caraglia M, Budillon A, Vitale G, et al. Modulation of molecular mechanisms involved in protein synthesis machinery as a new tool for the control of cell proliferation[J]. Eur J Biochem, 2000, 267(13):3919-3936.

[2]Anand N, Murthy S, Amann G, et al. Protein elongation factor eEF1A2 is a putative oncogene in ovarian cancer[J]. Nat Genet, 2002, 31(3):301-305.

[3]Kulkarni G, Turbin DA, Amiri A, et al. Expression of protein elongation factor eEF1A2 predicts favorable outcome in breastcancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2007, 102(1): 31-41.

[4]Scaggiante B, Dapas B, Bonin S, et al. Dissecting the expression ofEEF1A1/2 genes in human prostate cancer cells: the potential of EEF1A2 as a hallmark for prostate transformation and progression[J]. Br J Cancer, 2012, 106(1):166-173.

[5]Zhu H, Lam DC, Han KC, et al. High resolution analysis of genomic aberrations by metaphase and array comparative genomic hybridization identifies candidate tumour genes in lung cancer cell lines[J]. Cancer Lett, 2007, 245(1-2):303-314.

[6]Duanmin H, Chao X, Qi Z. eEF1A2 protein expression correlates with lymph node metastasis and decreased survival in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Hepatogastroenterology,2013, 60(124): 870-875.

[7]Grassi G, Scaggiante B, Farra R, et al. The expression levels of the translational factors eEF1A 1/2 correlate with cell growth but not apoptosis in hepatocellular carcinoma cell lines with different differentiation grade[J]. Biochi-mie, 2007, 89 (12):1544-1552.

[8]Ejiri S. Moonlighting function of polypeptide elongation factor 1: from actin bundling to zinc finger protein R1-associated nuclear localization[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2002, 66(1):1-21.

[9]Panasyuk G, Nemazanyy I, Filonenko V, et al. A2 isoform of mammalian translation factor eEF1A displays increased tyrosine phosphorylation and ability to interact with different signalling molecules[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40(1):63-71.

[10]Amiri A, Noei F, Jeganathan S,et al. eEF1A2 activates Akt and stimulates Akt-dependent actin remodeling, invasion and migration[J]. Oncogene, 2007, 26(27):3027-3040.

[11]Li Z, Qi CF, Shin DM, et al.Eef1a2 promotes cell growth, inhibits apoptosis and activates JAK/STAT and AKT signaling in mouse plasmacytomas[J]. PLoS One, 2010, 5(5): e10755.

[12]Rothschild MA, Oratz M, Schreiber SS. Albumin synthesis[J]. Int Rev Physiol, 1980，21: 249-274.

(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

*[基金項(xiàng)目] 重慶市衛(wèi)生局重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 2013-1-013)

Expression of eEF1A2 in hepatocellular carcinomaHUANG Yi1, QIU Fu-nan2, CHEN Dun-yan1, WU Yan-an1, LI Feng3, HUANG Xiao-li1, WU Wen-bing1

(1DepartmentofClinicalLaboratory，2DepartmentofHepatobiliarySurgery，3DepartmentofPathology,ProvincialClinicalCollege,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China.E-mail:hyi8070@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the expression of eukaryotic elongation factor 1A2 (eEF1A2) in the hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and the effects of eEF1A2 over-expression on the biological behaviors of the HCC cells. ME-THODS: The expression of eEF1A2 at mRNA and protein levels in the HCC tissues and matched liver tissues from 62 HCC patients, and 20 normal liver tissues were detected by the methods of real-time PCR and immunohistochemical staining, respectively. The mRNA and protein expression of eEF1A2 in the HCC cells was also determined by real-time PCR and Western blot, respectively. The lentivirus containing eEF1A2 gene was constructed, and was used to infect the HCC cells with low eEF1A2 expression. The expression of eEF1A2 at mRNA and protein levels in the infected cells was detected by real-time PCR and Western blot, respectively. The cell activity, cell cycle and mRNA expression of albumin were measured by MTT assay, DNA ploid analysis and real-time PCR, respectively.RESULTS: The mRNA expression levels and protein expression positive rates of eEF1A2 in the 62 cases of HCC tissues, were significantly higher than those of 62 matched liver tissues and 20 normal liver tissues (P<0.01). eEF1A2 mRNA and protein were highly expressed in SMMC-7721 cells and BEL-7402 cells, and expressed in SK-HEP-1 cells at low level. The expression of eEF1A2 at mRNA and protein levels in the SK-HEP-1 cells was significantly enhanced by infection of GV287-eEF1A2 expression lentivirus.Compared with negative control group (transfected with negative control lentivirus), the cell activity in eEF1A2 over-expression group (transfected with GV287-eEF1A2 expression lentivirus) was significantly enhanced, the mRNA expression of albumin was remarkably reduced, and the cells in G0/G1phase were significantly decreased with increased percentage of the cells in S and G2/M phases.CONCLUSION: eEF1A2 is selectively over-expressed in human HCC cancer tissues. eEF1A2 might be a putative oncoprotein in HCC. eEF1A2 over-expression has noticeable effects on the HCC cell proliferation enhancement, differentiation inhibition, and cell cycle acceleration through the G0/G1phase to S phase and G2/M phases.

[KEY WORDS]Eukaryotic elongation factor 1A2; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation; Cell cycle

通訊作者△Tel: 023-89011536; E-mail: 13220327680@163.com

[收稿日期]2015- 06- 16[修回日期] 2015- 08- 30

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2151- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.006

[中圖分類號(hào)]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A