別彩群，　黃秋燕，　顏　英，　石　珩，　湯紹輝△

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 深圳 518104； 2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

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RNAi介導(dǎo)的IGF1R基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移與侵襲的影響*

別彩群1，黃秋燕2，顏英2，石珩2，湯紹輝2△

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 深圳 518104；2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 研究RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)的胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移與侵襲的影響。方法: 設(shè)計(jì)并篩選抑制IGF1R mRNA表達(dá)效率最高的siRNA序列，構(gòu)建該序列的慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。將包裝好的慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞，篩選沉默IGF1R基因表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。將上述穩(wěn)定細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞IGF1R mRNA表達(dá)變化，細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移與侵襲能力變化，以及Ki-67、p-AKT、p-ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21、BCL-XL的蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果: 與空白及陰性對(duì)照組比較，感染攜帶IGF1R干擾序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞IGF1R mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，細(xì)胞增殖活性明顯降低，細(xì)胞凋亡顯著增加，細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯受到抑制，細(xì)胞中IGF1R、Ki-67、p-AKT、p-ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21及BCL-XL蛋白表達(dá)水平均顯著降低。結(jié)論: RNAi介導(dǎo)的IGF1R基因沉默可明顯抑制Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及惡性生物學(xué)特征，這可能與IGF1R表達(dá)水平顯著下調(diào)而引起上述調(diào)控細(xì)胞增殖、抗凋亡基因以及相關(guān)信號(hào)通路基因的蛋白表達(dá)水平顯著降低有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]RNA干擾； 胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體； 肝細(xì)胞癌

胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)是一種酪氨酸激酶跨膜蛋白，由2個(gè)α亞單位和2個(gè)β亞單位構(gòu)成。IGF1R廣泛表達(dá)于多種類型的細(xì)胞表面，參與介導(dǎo)胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)和主要的IGF2的生物學(xué)功能，與細(xì)胞的增殖分化、胚胎的發(fā)育密切相關(guān)[1]。近年研究表明，IGF1R在多種惡性腫瘤包括肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，IGF1R的過表達(dá)可能成為惡性腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)[2-3]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)所誘導(dǎo)的一種特異性基因沉默現(xiàn)象。本研究構(gòu)建針對(duì)IGF1R基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)前體——短發(fā)夾RNA(short harpin RNA，shRNA)的慢病毒載體，感染Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞，觀察對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移與侵襲能力的影響及其機(jī)制。

材料和方法

1材料

LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Invitrogen，SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)于TOYOBO，PLVX-shRNA2載體購(gòu)于Clontech，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Keygen，TRIzol試劑及細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑購(gòu)于Promega，Huh7和HepG3B肝癌細(xì)胞株、HL-7702、293T細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，抗IGF1R、抗Ki-67、抗p-ERK1、抗Gli1、抗p-AKT、抗cyclin D1、抗β-catenin、抗p21、抗BCL-XL及抗GAPDH抗體購(gòu)于Abcam。

2方法

2.1針對(duì)IGF1R基因的siRNA設(shè)計(jì)與篩選根據(jù) siRNA 設(shè)計(jì)原則，參照IGF1R mRNA序列設(shè)計(jì)并合成3對(duì)siRNA序列(IGF1R_001、IGF1R_002、IGF1R_003)及1對(duì)無任何靶基因的siRNA，即陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA, NC siRNA)。培養(yǎng)Huh7肝癌細(xì)胞至匯合度為30%～50%，采用LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組，即NC siRNA組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(IGF1R_001、IGF1R_002和IGF1R_003)，每組設(shè)置25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L 3個(gè)siRNA濃度梯度。轉(zhuǎn)染24 h后，按TRIzol試劑盒說明抽提Huh7細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。IGF1R mRNA上游引物為5’-TTT CCC TTT GGA GTG TAG CT-3’，下游為5’-CAT TGG CTG TGC AGT CAA G-3’，片段長(zhǎng)度為180 bp；以18S rRNA為內(nèi)參照。每個(gè)樣本同時(shí)擴(kuò)增3 復(fù)管，并連續(xù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。采用相對(duì)定量法( 2-ΔΔCt) 表示目的基因表達(dá)量。

2.2針對(duì)IGF1R基因的RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建(1)篩選得到的高效沉默IGF1R基因的干擾序列為IGF1R_002：正義鏈為5’-CUG ACU ACA GGG AUC UCA UdTdT-3’，反義鏈為5’-AUG AGA UCC CUG UAG UCA GdTdT-3’。IGF1R基因靶序列為5’-CTG ACT ACA GGG ATC TCA T-3’。(2)設(shè)計(jì)表達(dá)IGF1R_002的shRNA序列：上游序列為5’-GATCC CTG ACT ACA GGG ATC TCAT TCA AGA GAT GAG ATC CCT GTA GTC AGT TTT TTT G-3’，下游序列為5’-AATTC AAA AAA ACT GAC TAC AGG GAT CTC ATC TCT TGA ATG AGA TCC CTG TAG TCA GG-3’(上游序列含BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，下游序列含EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn))。(3)雙鏈IGF1R_002制備：將表達(dá)IGF1R_002的上游序列與下游序列等體積混合后，沸水浴中煮沸 5 min，然后 72 ℃ 15 min，自然冷卻至室溫。此時(shí)即可與載體連接，或-20 ℃ 保存。(4)取pLVX-shRNA2 載體行BamH Ⅰ與EcoR Ⅰ雙酶切，酶切產(chǎn)物與雙鏈IGF1R_002連接，構(gòu)建成pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒載體。重組載體送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序分析。

2.3pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒包裝及滴度測(cè)定轉(zhuǎn)染前24 h，調(diào)整293T細(xì)胞密度(5×106)重新接種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后，細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。將各DNA溶液(pLVX-shRNA2-IGF1R_002載體20 μg，pHelper 1.0 載體15 μg，pHelper 2.0 載體10 μg)、LipofectamineTM2000試劑與Opti-MEM 混合均勻，在室溫下溫育20 min。將混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8 h后，以PBS液洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，加入含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞上清液，經(jīng)過離心和過濾收集病毒濃縮液，-80 ℃保存。取其中一支，采用倍比稀釋法檢測(cè)病毒滴度，取最佳病毒滴度做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒感染Huh7和HepG3B肝癌細(xì)胞感染前24 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7和HepG3B細(xì)胞分別按每孔2×105接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后，細(xì)胞密度達(dá)40%～50%時(shí)，加入各組包裝好的慢病毒及合適濃度的Polybrene。實(shí)驗(yàn)分3組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，即pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒組(感染pLVX-shRNA2-IGF1R_002的Huh7和HepG3B細(xì)胞，簡(jiǎn)稱IGF1R siRNA組)、空載體慢病毒組(感染pLVX-shRNA2空載體的Huh7和HepG3B細(xì)胞，簡(jiǎn)稱negative control組)及空白對(duì)照組(未感染任何病毒的Huh7和HepG3B細(xì)胞，簡(jiǎn)稱blank control組)。感染12 h后棄上清，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，檢測(cè)GFP蛋白表達(dá)情況，挑選熒光強(qiáng)度大的陽性克隆孔逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，即可得到沉默IGF1R表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5IGF1R mRNA表達(dá)檢測(cè)培養(yǎng)上述3組細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，按TRIzol試劑盒說明抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。IGF1R mRNA擴(kuò)增引物同前，采用相對(duì)定量法( 2-ΔΔCt) 表示目的基因表達(dá)量。

2.6細(xì)胞增殖檢測(cè)取上述3組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，分到96孔板，每孔100 μL。收集各個(gè)時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞(0 h、24 h、48 h、72 h)，加入MTS。孵育4 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm處吸光度(A)值。

2.7細(xì)胞周期檢測(cè)培養(yǎng)上述3組細(xì)胞48 h后，每組離心收集1×106細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇，于4 ℃固定過夜。1 000×g離心5 min收集細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞1次，加入含50 mg/L溴化丙啶和100 mg/L RNase A的PBS，4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.8細(xì)胞凋亡檢測(cè)培養(yǎng)上述3組細(xì)胞48 h后，離心收集細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使其濃度為1×109/L。取0.5 mL細(xì)胞懸液，加入1.25 μL Annexin V-FITC，置于室溫避光反應(yīng)時(shí)間為15 min。室溫1 000×g離心5 min收集細(xì)胞，用0.5 mL 預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸，加入10 μL 碘化丙啶，置于冰上避光保存，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光變化。

2.9細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)對(duì)于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，取上述3組細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室上室，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2孵育24 h后，取出小室，棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌3次并晾干，顯微鏡下觀察 6個(gè)視野細(xì)胞并拍照計(jì)數(shù)。對(duì)于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，首先用Matrigel膠包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠，使用前進(jìn)行基底膜水化，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

2.10蛋白表達(dá)檢測(cè)培養(yǎng)上述3組細(xì)胞48 h后，離心收集細(xì)胞，制備細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，用脫脂奶粉封閉。加入稀釋的I抗(抗IGF1R、抗Ki-67、抗p-ERK1、抗Gli1、抗p-AKT、抗cyclin D1、抗β-catenin、抗p21、抗BCL-XL及抗GAPDH)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)攝像及分析結(jié)果。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

分類資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料的比較采用ANOVA或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1針對(duì)IGF1R基因的siRNA設(shè)計(jì)與篩選結(jié)果

本研究設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)siRNA，即IGF1R_001、IGF1R_002及IGF1R_003，分別轉(zhuǎn)染Huh7肝癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染IGF1R_001、IGF1R_002及IGF1R_003的Huh7細(xì)胞中IGF1R mRNA表達(dá)量均有不同程度的降低，抑制效率約為31.7%～78.6%，其中IGF1R_002在100 nmol/L濃度時(shí)抑制效率最高，達(dá)78.6%，將此siRNA用于后續(xù)研究。

2慢病毒載體構(gòu)建、慢病毒包裝和滴度測(cè)定、穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建結(jié)果

根據(jù)篩選出的IGF1R_002，設(shè)計(jì)表達(dá)IGF1R_002的shRNA序列，克隆入pLVX-shRNA2 載體，構(gòu)建成pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒載體，測(cè)序結(jié)果顯示插入片段序列正確。將構(gòu)建好的慢病毒載體及2種病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，幾乎所有293T細(xì)胞均發(fā)出較亮的綠色熒光，提示轉(zhuǎn)染效率高，病毒包裝成功，見圖1。采用倍比稀釋法檢測(cè)病毒滴度為2.78×1011TU/L。將包裝好的慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞，挑選熒光強(qiáng)度大的陽性克隆孔逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到了沉默IGF1R基因表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，見圖2。

Figure 1.Green fluorescence photographs at 48 h after transfection with pLVX-shRNA2-IGF1R_002 lentiviral vector or negative control vector in 293T cells.

圖1pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒載體或陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后48 h綠色熒光圖

Figure 2.Green fluorescence photographs in Huh7 and Hep3B cell lines with or withoutIGF1Rgene silencing.

圖2沉默及未沉默IGF1R基因表達(dá)的Huh7和Hep3B穩(wěn)定細(xì)胞株熒光圖片

3IGF1R mRNA表達(dá)變化結(jié)果

圖3顯示，與正常肝細(xì)胞HL-7702相比，Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞IGF1R mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)；感染攜帶IGF1R干擾序列(IGF1RsiRNA)的慢病毒后，與blank control及negative control組相比較，IGF1RsiRNA 組Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞的IGF1R mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)。

Figure 3.Effect ofIGF1RsiRNA on IGF1R mRNA expression in Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖3IGF1RsiRNA對(duì)Huh7和Hep3B細(xì)胞IGF1R mRNA表達(dá)的影響

4細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡結(jié)果

與blank control及negative control組相比較，IGF1RsiRNA 組Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，從轉(zhuǎn)染后第1至第3天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.01)；早期、晚期及總凋亡均顯著增加(P<0.01)，見圖4～6。

5細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與blank control及negative control組相比較，IGF1RsiRNA 組Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力明顯受到抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖7、8。

6Western blot分析結(jié)果

與blank control及negative control組相比較，IGF1RsiRNA 組Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞IGF1R、Ki-67、p-ERK1、p-AKT、 Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21和BCL-XL蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，見圖9。

Figure 4.Effect ofIGF1RsiRNA on the proliferation of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

圖4IGF1RsiRNA對(duì)Huh7和Hep3B細(xì)胞增殖的影響

Figure 5.Effect ofIGF1RsiRNA on the cell cycle of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖5IGF1RsiRNA對(duì)Huh7和Hep3B細(xì)胞周期的影響

Figure 6.Effect ofIGF1RsiRNA on apoptosis of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖6IGF1RsiRNA對(duì)Huh7和Hep3B細(xì)胞凋亡的影響

Figure 7.Effect ofIGF1RsiRNA on the migration of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖7IGF1RsiRNA對(duì)Huh7和Hep3B細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 8.Effect ofIGF1RsiRNA on the invasion of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖8IGF1RsiRNA對(duì)Huh7和Hep3B細(xì)胞侵襲能力的影響

討論

胰島素樣生長(zhǎng)因子軸由IGF1、IGF2、IGF1R、IGF2R、胰島素受體及IGF結(jié)合蛋白組成，它們所介導(dǎo)的信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等方面發(fā)揮重要作用，其表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。IGF1R是細(xì)胞表面的酪氨酸蛋白激酶受體，它介導(dǎo)IGF1及主要的IGF2生物學(xué)功能[5]。研究表明，在HCC中，IGFs的失衡主要表現(xiàn)為IGF2和IGF1R過表達(dá)，且IGF2 mRNA 與IGF1R mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)。IGF2與IGF1R結(jié)合后激活2條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即PI3K/Akt和MAPK，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂, 誘導(dǎo)細(xì)胞增生，抑制凋亡, 促進(jìn)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[6-9]。因此，抑制IGF2或IGF1R過表達(dá)，干預(yù)該通路的活化有可能成為HCC治療的新靶點(diǎn)[10]。目前，有關(guān)應(yīng)用小分子抑制劑如靶向IGF1R的RNAi， 進(jìn)行HCC基因治療的研究非常少，且不夠深入。

在本研究中，我們根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)靶向IGF1R的siRNA序列，分別轉(zhuǎn)染Huh7肝癌細(xì)胞，結(jié)果篩選出IGF1R_002的抑制效率最高，達(dá)78.6%。將表達(dá)IGF1R_002的shRNA序列克隆入pLVX-shRNA2 載體，構(gòu)建成pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒載體，經(jīng)293T細(xì)胞包裝成功后，檢測(cè)病毒滴度為2.78×1011TU/L。將慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞，挑選熒光強(qiáng)度大的陽性克隆孔逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到了沉默IGF1R基因表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。將上述穩(wěn)定細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染攜帶IGF1R干擾序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞IGF1R mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，細(xì)胞增殖活性明顯降低，細(xì)胞周期阻滯于G1期，細(xì)胞凋亡顯著增加，細(xì)胞遷移能力和侵襲能力明顯受到抑制。這些結(jié)果提示，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默IGF1R基因表達(dá)可顯著抑制Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低其惡性生物學(xué)特征。進(jìn)一步基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，感染攜帶IGF1R干擾序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞的IGF1R、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67、PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-AKT及p-ERK1、Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白(Gli1)、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白cyclin D1及p21、細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)蛋白BCL-XL的表達(dá)水平均顯著降低。此結(jié)果提示：(1)Ki-67、AKT、ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21及BCL-XL基因可能是IGF1R的下游調(diào)控靶基因，一般情況下IGF1R對(duì)其可能是正向調(diào)控；(2)Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞中IGF1R的表達(dá)抑制可導(dǎo)致上述基因表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)而引起Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖明顯抑制，惡性生物學(xué)行為降低；(3)采用RNA干擾技術(shù)沉默IGF1R基因表達(dá)可能成為HCC基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

Figure 9.Effect ofIGF1RsiRNA on IGF1R and other protein expression in Huh7 and Hep3B cells. BL: blank control; NC： negative control; Si:IGF1RsiRNA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖9IGF1RsiRNA對(duì)Huh7和Hep3B細(xì)胞IGF1R和其它蛋白表達(dá)的影響

既往研究顯示，多條細(xì)胞信號(hào)通路的異?；罨瘏⑴c了HCC的發(fā)生發(fā)展，這些信號(hào)通路包括PI3K/Akt、MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin、IGFs等[11-15]。此外，更為重要的是，在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中，Hedgehog信號(hào)通路與PI3K/Akt、MAPK及Wnt/β-catenin信號(hào)通路之間存在著重要的交叉對(duì)話[15]，PI3K/Akt信號(hào)通路又可調(diào)控Wnt/β-catenin通路[16]，而Wnt/β-catenin通路也與PI3K/Akt、MAPK通路之間存在著交叉對(duì)話[17]。這些研究結(jié)果表明，在HCC中，PI3K/Akt、MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin等信號(hào)通路之間相互影響、相互調(diào)控，共同影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。在本研究中，沉默Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞IGF1R基因的表達(dá)，結(jié)果導(dǎo)致上述信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明IGF1R可能調(diào)控PI3K/Akt、MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，或提示IGF1R可能先影響上述一至二條信號(hào)通路的活性，再進(jìn)一步通過交叉對(duì)話使其它通路的活性發(fā)生改變，共同促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，目前國(guó)內(nèi)外尚未見相似研究報(bào)道。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

*[基金項(xiàng)目]福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目(No. 2013-ZQN-JC-2)；福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 2014Y0009)

Effect of RNAi-mediatedIGF1Rgene silencing on growth, migration, and invasion of hepatocellular carcinoma cellsBIE Cai-qun1, HUANG Qiu-yan2, YAN Ying2, SHI Heng2, TANG Shao-hui2

(1DepartmentofGastroenterology,TheAffiliatedShenzhenShajingHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Shenzhen518104,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tangshaohui205@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of RNA interference (RNAi)-mediated insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) gene silencing on the growth, migration, and invasion of hepatocellular carcinoma cells. METHODS: The most effective siRNA targeting IGF1R gene was designed and screened. After lentiviral expression vector pLVX-shRNA2-IGF1R carrying the most effective siRNA sequence was constructed, it was transfected into 293T cells and packed into pLVX-shRNA2-IGF1R lentivirus. Huh7 and Hep3B cells were infected with the pLVX-shRNA2-IGF1R lentivirus to screen the positive clone Huh7 cells and Hep3B cells with the lentivirus. These Huh7 cells and Hep3B cells were cultured to analyze the mRNA level of IGF1R, cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis, cell migration/invasion, and the protein levels of IGF1R, Ki-67, p-AKT, p-ERK1, Gli1, β-catenin, cyclin D1, p21 and BCL-XL. RESULTS: The mRNA expression of IGF1R in Huh7 cells and Hep3B cells with pLVX-shRNA2-IGF1R lentivirus was significantly reduced. The proliferation of these cells was remarkably inhibited, and the number in G1phase was increased significantly. The percentages of apoptotic cells were increased markedly, and the number of cell migration/invasion was decreased markedly. The protein levels of IGF1R, Ki-67， p-AKT, p-ERK1, Gli1, β-catenin, cyclin D1, p21 and BCL-XL were decreased significantly compared with the blank control group and negative control group. CONCLUSION: The RNAi-mediated IGF1R gene silencing significantly suppresses the growth and the malignant biological characteristics of Huh7 cells and Hep3B cells, which may be involved in the reduced protein levels of the above genes induced by down-regulation of IGF1R expression.

[KEY WORDS]RNA interference; Insulin-like growth factor 1 receptor; Hepatocellular carcinoma

通訊作者△Tel： 0591-88216378； E-mail： hyi8070@126.com

[收稿日期]2015- 06- 15[修回日期] 2015- 09- 24

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2144- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.005

[中圖分類號(hào)]R735； R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A