★　熊江艷　陳波*　劉峰,3　胡鐵漢　(.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院　貴陽 55000；.貴陽中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院　貴陽 55005；3.九江學(xué)院附屬醫(yī)院急診科　江西 九江 33000)

*基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81160456)；貴州省科技基金項目(黔科合J字[2014]2030號)。

**第一作者：熊江艷(1982—)，女，碩士。研究方向：針灸推拿的基礎(chǔ)與護理運用。

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張力刺激對經(jīng)脈筋膜成纖維細胞整合素β1亞基影響的體外研究*

★熊江艷1**陳波2***劉峰2,3胡鐵漢2(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院貴陽 550002；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院貴陽 550025；3.九江學(xué)院附屬醫(yī)院急診科江西 九江 331000)

*基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81160456)；貴州省科技基金項目(黔科合J字[2014]2030號)。

**第一作者：熊江艷(1982—)，女，碩士。研究方向：針灸推拿的基礎(chǔ)與護理運用。

摘要：目的：探討體外張力刺激對來自經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞的整合素β1亞基的影響，從實驗和理論的角度佐證針推基本機械力學(xué)感受的基本原理。方法：應(yīng)用不同強度的張力對培養(yǎng)的經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞施加單次和多次刺激，成纖維細胞整合素β1表達情況通過熒光顯微鏡技術(shù)和圖像分析技術(shù)進行觀測。結(jié)果：跟空白對照組相比，在不同的刺激強度因素和刺激次數(shù)情況下，經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞整合素β1熒光密度表達均增高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000<0.01)。結(jié)論：在張力刺激作用下，經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞整合素β1表達量發(fā)生了改變，在微觀力學(xué)上可能揭示針推張力刺激在經(jīng)脈組織細胞中信號感受的細胞生物學(xué)機制。

關(guān)鍵詞：張力刺激；經(jīng)脈；筋膜；成纖維細胞；整合素β1

針灸推拿是臨床護理常用的治療手段之一，而針灸推拿操作過程中存在大量的生物力學(xué)現(xiàn)象[1]。筆者課題組前期的研究表明：經(jīng)脈腧穴來源的筋膜結(jié)締組織成纖維細胞受壓力刺激作用后，胞膜上力感受器分子中幾種整合素(Integrins)亞基的表達分布和含量均發(fā)生變化，這證實了整合素確是經(jīng)脈非神經(jīng)組織細胞感受針推治療信息的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。而經(jīng)脈相關(guān)筋膜成纖維細胞如何感受張力刺激目前尚不清楚。因此，本課題一方面選擇張力為研究對象，另一方面載體的選擇上繼續(xù)選擇同經(jīng)脈腧穴相關(guān)筋膜成纖維細胞，在研究載體上獨立施加不同強度的張力，觀察經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞整合素β1表達變化情況，深入探討體外張力刺激對經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞力學(xué)信號生物感傳通路的影響，為針推機械力刺激的細胞生物學(xué)作用原理提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1材料和方法

1.1主要試劑兔抗鼠整合素β1多克隆一抗(USA，Santa Cruz Crop；批號：SC-8978)、抗熒光淬滅封片液(江蘇，碧云天生物技術(shù)研究所；批號：P0126)、FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(KPL；批號：N1230010)、標(biāo)準型胎牛血清(FCS，Hyclone，100mL；批號：BUC175)、低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，USA，500mL；批號：NUH0187)、Ⅰ型膠原酶(Sigma，USA，100mg；批號：TA0512)、胰蛋白酶(Gibco，USA，10g；批號：MA446)、新生小牛血清(批號：090428；100mL，哈里生物工程有限公司)、封閉用正常山羊血清原液(北京，中杉金橋；批號：111106)。

1.2主要實驗器材CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC型，SANYO，Japan)、熒光顯微鏡及組像系統(tǒng)(Olympus，1×71，Japan)、成都電子科技大學(xué)提供的四點彎曲力學(xué)加載裝置、HHWCu600型電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械廠)、細胞培養(yǎng)瓶(美國Costar公司)。

1.3經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞的原代、傳代培養(yǎng)將SD孕鼠(四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院動物中心提供，動物證號：SCXK(111)2009-09，孕期14天)頸椎脫臼處死，用手術(shù)剪剪開腹腔，將子宮剪下，在超凈臺上，用眼科剪和鑷子，將子宮剪開，取出胎鼠，置于解剖顯微鏡下，取胎鼠背部正中線督脈及其附近皮膚及皮下組織，寬約4mm，用手術(shù)刀刮取皮下筋膜結(jié)締組織，置于培養(yǎng)皿中，加3mL0.1%Ⅰ型膠原酶,用眼科剪將組織剪成糊狀，置于水浴搖床中消化30min；按成纖維細胞常規(guī)體外實驗方法提取、培養(yǎng)和傳代擴增細胞量。

1.4經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞張力加載實驗

1.4.1加力板準備將四點彎曲細胞應(yīng)變片置于濃硫酸中，隔夜后用清水沖洗，然后三蒸水重復(fù)沖洗數(shù)遍，在75%乙醇中浸泡24h，去除油脂成分；在無菌、超凈環(huán)境下，經(jīng)過紫外線照射殺菌，接種細胞。

1.4.2細胞種板操作步驟取第5-8代的經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞，制細胞懸浮液，按細胞密度1×104/mL接種于四點彎曲細胞應(yīng)變片上，1mL/片，2～4h后在培養(yǎng)皿中加入無血清的DMEM20mL持續(xù)培養(yǎng)24h，細胞同步化后，換20mL 10%FCS的DMEM。

1.4.3實驗設(shè)計與分組(1)分組：將細胞隨機分為空白對照組，低、中、高強度張力刺激組，單次加力組和多次加力組。(2)張力刺激組處理：將張力刺激組細胞置于四點彎曲力學(xué)加載裝置，然后移入100%濕度、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，分別將四點彎曲力學(xué)加載裝置位移調(diào)節(jié)至0.5mm(1000μstrain，低強度張力刺激)、1mm(2000μstrain，中強度張力刺激)和1.5mm(3000μstrain，高強度張力刺激)，0.5Hz頻率單次加力，2h/次；多次加力時間間隔24h，取出細胞備檢時間為加力結(jié)束后再繼續(xù)培養(yǎng)2h。(3)空白對照組處理：將空白對照組置于100%濕度、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，不作任何處理，取出備檢時間與各張力組一致。

1.5整合素β1表達檢測(免疫熒光技術(shù))移棄培養(yǎng)基，PBS清洗5min/次，3次；加入40g/L的多聚甲醛2mL毫升，固定30min，PBS洗3次，5min/次；加0.5%TritonX-100置20min，PBS清洗3次，5min/次；避光加3%H2O2去離子水20min，PBS清洗3次，5min/次；加5%正常山羊血清封閉液30min；加1∶100兔抗鼠整合素β1多克隆一抗4℃過夜后，復(fù)溫30min，PBS避光清洗3次，5min/次；避光加1∶20FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗30min，PBS避光洗3次，5min/次；避光在載玻片上滴加一滴抗熒光淬滅封片液，血蓋片細胞面向下置于載玻片上封片避光送檢，熒光顯微鏡下采圖。然后，采用Image Pro Plus圖像定量分析軟件，掃描加力板上顯色成纖維細胞進行染色積分光密度定量測量。

圖1　空白對照組熒光密度(單次加力，×400)　　　　　圖2　低強度張力刺激組熒光密度(單次加力，×400)

注：析因方差分析表明,刺激強度因素MS=7.705，F(xiàn)=12773.860，P=0.000<0.01；刺激次數(shù)因素MS=0.259，F(xiàn)=429.876，P=0.000<0.01；刺激強度與刺激次數(shù)綜合因素MS=14.712，F(xiàn)=24389.833，P=0.000<0.01。

2結(jié)果

從圖1-8、表1可以看出：①單次刺激各組中以3000μstrain組的熒光密度最大，空白對照組的熒光密度最?。虎诙啻未碳じ鹘M中熒光密度最大出現(xiàn)在2000μstrain組，熒光密度最小出現(xiàn)在3000μstrain組；③本次實驗熒光密度最大組是2000μstrain多次刺激組；④實驗組與空白對照組對比，不同的張力刺激強度因素與不同的刺激次數(shù)因素對經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞整合素β1熒光密度表達增高有顯著統(tǒng)計差異(P=0.000)；⑤張力刺激次數(shù)和刺激強度兩因素累加對經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞整合素β1熒光密度的提高有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。

3討論

從毫針針刺力學(xué)理論分析[1]，當(dāng)毫針刺入腧穴后，如捻轉(zhuǎn)達到一定幅度，在不直接接觸針體的鄰近區(qū)域，穴區(qū)組織細胞會受到纏繞針身的細胞基質(zhì)傳導(dǎo)的、沿針體轉(zhuǎn)動切線方向的牽張力作用；行針是以擺動為主要操作的，針體對周邊組織也會產(chǎn)生與針體擺動方向相反的牽張力刺激。從推拿按摩手法的力學(xué)維向分類[3]，不同手法又可分為一維力型手法、二維力型手法、三維力型手法，因此，推拿按摩的力學(xué)刺激中張力作用也是重要的力學(xué)形式之一。

現(xiàn)代研究表明：筋膜結(jié)締組織是經(jīng)絡(luò)腧穴的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，除了神經(jīng)生物學(xué)機制[5]，針灸推拿發(fā)揮治療作用還存在非神經(jīng)生物學(xué)機制[6]。在非神經(jīng)生物學(xué)機制中，整合素是力學(xué)信息生物轉(zhuǎn)換的重要力感受器分子之一——整合素是一個膜受體家族[7]，α、β兩條鏈以非共價鍵連接而成的異源雙體構(gòu)成成員分子。α、β兩條鏈都具有胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)和跨膜區(qū)，β鏈膜內(nèi)與細胞骨架相連，β鏈胞外區(qū)與胞外基質(zhì)相連，似一座橋梁介導(dǎo)細胞內(nèi)外信息的傳遞。由于組成亞基不同，整合素主要分為β1、β2、β3等3類，功能有所差異。其中，整合素β1亞基與整合素α1-8和αv亞基可分別組成整合素VLA-1-6、α7β1、α8β1及αvβ1(VNR)共12種整合素，在各種細胞中廣泛表達。當(dāng)力學(xué)刺激作用于組織或細胞后，Integrins在細胞膜上銜接集聚，Integrin細胞外區(qū)域直接與ECM蛋白結(jié)合，而胞漿內(nèi)的區(qū)域則與細胞內(nèi)的細胞骨架(主要是微絲)和信號復(fù)合體結(jié)合，共同形成局部黏附，激活局部黏附激酶通道，引起細胞核內(nèi)基因表達的變化[8]。Ingber[9-10]等發(fā)現(xiàn)扭力對細胞表面的作用，可以激發(fā)cAMP的信號級聯(lián)反應(yīng)和后續(xù)基因表達，該過程被認為是由Integrinβ1的變形傳遞至微絲激發(fā)所致，因此，目前認為力的感傳方式中Integrins途徑是最主要的途徑之一。

本次研究顯示：經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞整合素β1可以感受不同程度的張力刺激：單次刺激，在重度刺激強度下經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞整合素β1表達量高；多次刺激，在中度刺激強度下經(jīng)脈相關(guān)筋膜結(jié)締組織成纖維細胞整合素β1表達量高。這表明針灸推拿學(xué)的臨床意義可能是：張力是經(jīng)絡(luò)腧穴的有效刺激手段，在采用針灸推拿進行臨床護理時，短時間周期或單次的治療，以能產(chǎn)生張力刺激較重手法為首選；長時間周期或多次治療，以能產(chǎn)生張力刺激較輕的手法為首選，它可使經(jīng)穴組織細胞的感受能力保持在較高水平。但這需要在體研究的進一步驗證。

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收稿日期：(2015-07-08)編輯：萬崇毅

中圖分類號：R245.2

文獻標(biāo)識碼：A

通信作者：***陳波(1974—)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：針灸推拿的基礎(chǔ)與臨床運用。E-mail:chenbomed@163.com。