孫曉璐,　張新紅,　王明躍

(阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程學(xué)院， 安徽 阜陽　236031)

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白酒大曲酵母菌的篩選

孫曉璐,張新紅,王明躍

(阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程學(xué)院， 安徽 阜陽236031)

摘要：對(duì)某釀酒企業(yè)提供的春季大曲進(jìn)行了分離、純化。通過對(duì)具有明顯酵母菌特征的微生物進(jìn)行生理、生化實(shí)驗(yàn)，得到6株性能優(yōu)良、形態(tài)特征明顯的酵母菌。通過實(shí)驗(yàn)比較得到具有一定優(yōu)勢(shì)的Q2菌株。

關(guān)鍵詞：白酒; 酵母菌; 分離

0引言

大曲是釀造傳統(tǒng)大曲酒的糖化劑、發(fā)酵劑和增香劑，也是傳統(tǒng)白酒釀造的中間原料和生產(chǎn)動(dòng)力，含有多種微生物及產(chǎn)生的多種酶類，在釀造過程中起著重要的糖化、發(fā)酵和生香的作用，直接間接地影響著白酒的質(zhì)量和風(fēng)格。

濃香型白酒大曲的制作工藝為自然發(fā)酵，富集了原材料和環(huán)境中的微生物，微生物區(qū)系十分復(fù)雜，酵母菌是大曲主要功能微生物菌群之一，主要有產(chǎn)酒的酒精酵母類群和產(chǎn)香的產(chǎn)酯酵母類群，不同類群酵母菌的數(shù)量及構(gòu)成對(duì)大曲酒產(chǎn)率及風(fēng)格特征具有極大影響[1]。因此，研究大曲中酵母菌的組成對(duì)提高大曲質(zhì)量有重要意義，文中對(duì)皖北地區(qū)某釀酒企業(yè)提供的春季大曲進(jìn)行了分離、純化，通過對(duì)具有明顯酵母菌特征的微生物進(jìn)行生理、生化實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)比較得出在發(fā)酵過程中性能優(yōu)良具有工業(yè)利用價(jià)值的優(yōu)勢(shì)菌株，為釀酒企業(yè)提供了數(shù)據(jù)支撐，在實(shí)際生產(chǎn)中具有一定的指導(dǎo)意義[2]。

1材料與方法

1.1　樣品

大曲：皖北某釀酒企業(yè)，春季大曲。

1.2　試劑和設(shè)備

孟加拉紅、青霉素鈉、TTC、95%乙醇、苯酚紅、美藍(lán)、氯化鈉、葡萄糖、酵母膏和牛肉膏等。

儀器：超凈工作臺(tái)、低溫離心機(jī)、壓力滅菌鍋、冰箱、數(shù)顯恒溫振蕩器、恒溫水浴鍋、無菌濾膜、分析用天平、微波爐、精密pH計(jì)、鼓風(fēng)干燥箱、普通光學(xué)顯微鏡、熒光倒置顯微鏡、安捷倫高效氣相色譜儀。

培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基、TTC培養(yǎng)基、保藏用斜面培養(yǎng)基。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1　酵母菌的分離

取大曲10 g，以無菌操作加入到無菌水500 mL中，取菌液涂布于YEPD固體平皿，27 ℃培養(yǎng)72 h，長出乳白色菌落，選擇具有典型酵母菌落特征的單菌落，劃線分離3次，經(jīng)鏡檢為純種后用接種針接入斜面培養(yǎng)基，長出后菌落于低溫保存。

2.2　酵母菌的篩選

TTC染色：選擇菌落數(shù)合適的YEPD平板，侵入48 ℃左右的TTC培養(yǎng)基覆蓋菌落，凝固后避光在27 ℃保存3 h，觀察菌落顏色變化。通過觀察酵母菌菌落被TTC染成橙色的深淺，來判定該菌株發(fā)酵產(chǎn)酒精能力的強(qiáng)弱，從中挑選出染色較深、形態(tài)特征明顯的單菌落，用接種針劃開TTC培養(yǎng)基層，挑出優(yōu)勢(shì)菌株，接入固體斜面培養(yǎng)基進(jìn)行低溫保存[3-4]。

2.3　大曲中酵母菌的形態(tài)觀察

2.3.1大曲酵母菌的個(gè)體鏡檢

取美藍(lán)染色液，制作臨時(shí)裝片，于100×油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄菌體形態(tài)、大小、出芽情況。

2.3.2大曲酵母細(xì)胞的倒置顯微鏡觀察

取菌體形態(tài)明顯的酵母菌，置于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行測(cè)定，得到相關(guān)酵母菌形態(tài)圖像進(jìn)行比較。

2.4　酵母菌菌落觀察

將保藏的優(yōu)勢(shì)菌株分別進(jìn)行YEPD固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基生長，觀察菌落的大小、形狀、顏色、透明度、邊緣、質(zhì)地，以及在液體培養(yǎng)基中菌落的渾濁度、有無氣泡等生理特征進(jìn)行觀察，記錄。

2.4.1菌懸液的制備

取10 mL發(fā)酵液進(jìn)行低速離心分離，洗滌菌體3次后，將所得菌體于10 mL 0.9%的生理鹽水中，制得菌體懸濁液，依次稀釋到10-3倍、10-2倍、10-1倍，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體密度。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用紫外分光光度計(jì)調(diào)制在波長560 nm處測(cè)空白的YEPD液體培養(yǎng)基，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1　復(fù)篩后幾株酵母菌的特性觀察

在傳統(tǒng)大曲酒發(fā)酵過程中，酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精過程需要大量的五谷為原料，近幾年來，由于原料價(jià)格不斷提高，在一定程度上促使人們往價(jià)格低廉的麩糠等原料轉(zhuǎn)移。優(yōu)勢(shì)酵母不單能夠利用淀粉水解產(chǎn)生的大部分寡糖，包括比麥芽三糖鏈更長的糊精和異麥芽糖，還能夠分解一定的纖維素糖，因此，在對(duì)釀酒酵母的發(fā)酵性能上必定具有一定要求，該菌株應(yīng)該具有生產(chǎn)迅速，并能夠?qū)Φ吞呛康脑线M(jìn)行充分利用、不易染菌等優(yōu)勢(shì)[5-6]。

通過初篩得到若干菌株，對(duì)長勢(shì)優(yōu)良、具有明顯酵母菌特征的菌株進(jìn)行挑選，得6株優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，通過觀察幾株酵母菌的形態(tài)、菌落特征得到相關(guān)數(shù)據(jù),并對(duì)其進(jìn)行分析。

酵母菌的菌落特征及呼吸強(qiáng)度觀察見表1。

由表1可以看出，初篩、復(fù)篩得到的6株酵母菌在菌落特征、呼吸強(qiáng)度上均體現(xiàn)出了不同的情況，分析具體情況得到以下結(jié)論，在初期生長的12 h時(shí)，酵母菌均無明顯變化，在生長24 h后，有部分菌株進(jìn)入了成長階段，其中Q1，Q2，Q4為最先成長菌株。

在進(jìn)入36 h時(shí)，Q6菌株出現(xiàn)了與其它不同的微黃色,但生長緩慢，菌株生殖方式為多邊芽殖，孢子呈橢圓形向外圍散開，在成長較快的菌株Q1，Q2，Q4的平皿上出現(xiàn)了表面圓滑乳白色的菌落，進(jìn)入到快速生長階段；通過第72 h后的觀察，可以看到先生長的Q1，Q2，Q4的平皿上出現(xiàn)了表面干燥有褶皺現(xiàn)象，邊緣不整齊，開始進(jìn)入菌體老化階段，Q6菌株出現(xiàn)了黃色凸起菌落。

表1　酵母菌的菌落特征及呼吸強(qiáng)度觀察

注：-為無明顯變化；+為酵母生長較慢；++為酵母生長平穩(wěn)；+++為酵母生長較快。

3.2　優(yōu)勢(shì)酵母菌的細(xì)胞特征觀察

采用熒光倒置顯微鏡對(duì)優(yōu)勢(shì)酵母菌Q1，Q2，Q4，Q6進(jìn)行觀察，各菌株細(xì)胞分別呈現(xiàn)為卵圓形和橢圓形，芽殖大小為3~7 μm，分別為Q1，Q2，Q4，Q6，其中Q6可以觀察到較明顯的裂殖現(xiàn)象，如圖1所示。

圖1　酵母菌Q1，Q2，Q4，Q6美藍(lán)染色結(jié)果

3.3　優(yōu)勢(shì)酵母菌的發(fā)酵性能分析

將優(yōu)勢(shì)菌株Q1，Q2，Q4，Q6通過YEPD的發(fā)酵液培養(yǎng)72 h，在發(fā)酵過程中對(duì)各菌株的發(fā)酵液進(jìn)行定時(shí)采樣，分析其在發(fā)酵過程中酸堿度及酒精度，見表2。

表2　優(yōu)勢(shì)酵母菌的發(fā)酵性能分析

由表2可以看出，在發(fā)酵過程中各菌株的酸堿度變化不大，酒精含量在發(fā)酵72 h后都可以達(dá)到最大值，其中Q2酵母菌在發(fā)酵72 h后酒精產(chǎn)量為最高，說明該菌株在大曲酵母中占有明顯優(yōu)勢(shì)，可以作為發(fā)酵過程中的主要生產(chǎn)菌株[7-8]。

發(fā)酵時(shí)間短，產(chǎn)生酒精能力強(qiáng),這和酵母菌在酒精生產(chǎn)中有一定的要求是一致的，酵母菌在酒精生產(chǎn)中要發(fā)酵能力強(qiáng)并且迅速，有較強(qiáng)的增殖能力，對(duì)乙醇具有一定的耐受力，能在較高濃度的酒精發(fā)酵醪液中發(fā)酵，生產(chǎn)性能穩(wěn)定，變異性小，發(fā)酵過程中產(chǎn)生較少量泡沫，可以抵抗雜菌，可視為生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)菌株[9-10]。

4結(jié)語

本研究以白酒釀造中春季大曲為主要研究對(duì)象，分離、篩選并純化出具有一定特性的優(yōu)勢(shì)酵母菌菌株，通過不同酵母菌種的菌株的特性分析，初步研究了大曲中酵母菌群系的特性[11-12]。菌種的分離純化在方案設(shè)計(jì)上做到了全面、細(xì)致、不丟。因此，保證菌種樣品都進(jìn)行了3~4次的分離，分離培養(yǎng)的溫度應(yīng)適合大多數(shù)的酵母菌的生長溫度27 ℃。

酵母菌的鑒定主要以形態(tài)特征為主,并結(jié)合生理學(xué)特性，在形態(tài)特征的鑒定上包括菌株形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、芽孢特征，在生理鑒定上可以通過酸度發(fā)酵和產(chǎn)酒精量確定菌株的發(fā)酵性能。以其中6種菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，篩選出具有明顯發(fā)酵優(yōu)勢(shì)的Q2菌株。

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Screening of wine yeast in liquor

SUN Xiao-lu,ZHANG Xin-hong,WANG Ming-yue

(Vocational Technical Institute, Fuyang Vocational Technical College, Fuyang 236031, China)

Abstract：The alcohol from northern Anhui area is separated and purified. The obtained microorganism with saccharomycetes(wine yeast) characteristics are tested in physiological and biochemistry lab to get 6 kinds of fine and obvious saccharomycetes. Experimental results show that Q2 is superior to the others.

Key words：liquor; saccharomycetes; separation.

作者簡介：孫曉璐(1981-)，女，漢族，安徽太和人，阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，碩士，主要從事微生物技術(shù)方向研究,E-mail:303028607@qq.com.

基金項(xiàng)目：安徽省高等學(xué)校優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013SQRL137ZD); 安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2012B140); 安徽省教育廳質(zhì)量工程項(xiàng)目(20101336)； 阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院精品課程(2013zycxkc02)

收稿日期：2014-09-11

中圖分類號(hào)：TQ 925

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-1374(2015)01-0081-04

DOI:10.15923/j.cnki.cn22-1382/t.2015.1.17