李 媛 張愛麗 周 偉 錢子剛

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藥物研究

釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建及工藝優(yōu)化研究進展

李 媛 張愛麗 周 偉 錢子剛

云南中醫(yī)學院/中藥材優(yōu)良種苗繁育工程中心，云南 昆明 650500

釀酒酵母是合成天然產(chǎn)物的重要宿主菌，但在釀酒酵母中構(gòu)建遺傳穩(wěn)定性好、基因表達可控的代謝途徑并獲得高產(chǎn)菌株仍然是代謝工程和合成生物學中的難點，筆者系統(tǒng)介紹了目前釀酒酵母工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究進展為其代謝與合成提供一定的參考。

釀酒酵母；表達系統(tǒng)構(gòu)建；發(fā)酵優(yōu)化；合成生物學

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為酵母科酵母屬，單細胞真核微生物，細胞形態(tài)多呈卵形或者球形，直徑 5～10μm，以出芽生殖方式進行無性繁殖。其以研究背景清晰、代謝繁殖快、安全無毒、不致病等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于食品與醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域[1]。早在1996年已完成了對釀酒酵母的全基因組測序工作，其基因組包含16條染色體，全長為12068kb[2]。近年來，經(jīng)國內(nèi)外學者研究報道，釀酒酵母菌已經(jīng)成為一種重要的模式生物被廣泛的應(yīng)用于基因工程、蛋白表達及遺傳學分析等研究領(lǐng)域[3-4]，并圍繞酵母菌開展了酵母基因敲除技術(shù)、酵母基因定位技術(shù)、酵母功能基因芯片技術(shù)、釀酒酵母雙雜交技術(shù)等[5]。值得注意的是，由于酵母菌是最簡單的真核生物，而利用酵母菌表達動植物基因能在相當大的程度上闡明高等真核生物基因表達調(diào)控的基本原理以及基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，從而起到異源表達或鑒定目的蛋白的作用[6-7]，所以越來越多的學者致力于通過構(gòu)建釀酒酵母工程菌，建立酵母表達系統(tǒng)，并通過對發(fā)酵工藝的優(yōu)化得到高產(chǎn)菌株，合成細胞工廠以發(fā)酵生產(chǎn)植物源天然產(chǎn)物[8]。筆者將著重介紹近年來構(gòu)建的釀酒酵母基因工程菌在表達系統(tǒng)中的應(yīng)用及釀酒酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究進展。

1 釀酒酵母表達系統(tǒng)的研究進展

目前構(gòu)建酵母工程菌的途徑主要有兩種：一是在酵母底盤細胞中人工構(gòu)建目的產(chǎn)物的合成途徑，以實現(xiàn)快速大量的生產(chǎn)重要藥用有效成分或其中間體；二是基于合成途徑分支點的特點，通過抑制或下調(diào)目標途徑的競爭途徑以達到目的產(chǎn)物大量表達的方法。

1.1 釀酒酵母基因工程菌合成途徑的構(gòu)建 釀酒酵母表達系統(tǒng)擁有轉(zhuǎn)錄后加工修飾功能，培養(yǎng)條件簡便，生長繁殖迅速，在表達基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，且成本低廉，特別適合于穩(wěn)定表達有功能的外源蛋白質(zhì)，是最理想的重組真核蛋白質(zhì)生產(chǎn)制備用工具[9]。

釀酒酵母自身存在甲羥戊酸途徑，而該途徑的中間代謝物2,3-氧化角鯊烯恰恰為萜類物質(zhì)提供了關(guān)鍵的前體物質(zhì)，被認為是萜類合成最適宜的底盤宿主[10]。戴住波等[11-12]已在酵母底盤細胞中人工構(gòu)建了原人參二醇的合成途徑，實現(xiàn)了從單糖到稀有人參皂苷CK的生物合成。王貝貝[13]通過對釀酒酵母甲羥戊酸途徑中的限速酶過表達后，將成團泛菌和紅法夫酵母的β-胡蘿卜素的合成基因整合至酵母中，最終獲得了高產(chǎn)β-胡蘿卜素的酵母工程菌。可見，構(gòu)建代謝工程菌株，能快速大量的生產(chǎn)重要藥用有效成分或其中間體，為瀕危藥材的保護和可持續(xù)利用提供應(yīng)用基礎(chǔ)[14]。林庭庭[15]等將擬南芥中的羽扇豆醇合成酶基因整合到三萜底盤菌株中，創(chuàng)建了羽扇豆醇酵母人工細胞工廠，并獲得高產(chǎn)羽扇豆烷型三萜。王樂[16]在西洋參中以釀酒酵母菌作為受體菌分別構(gòu)建了原人參二醇合成酶基因、原人參三醇合成酶基因與達瑪烯二醇合成酶基因的異源表達載體，并將各異源表達載體分階段轉(zhuǎn)入同一釀酒酵母細胞中獲得異源共表達工程菌，經(jīng)檢測其產(chǎn)量可達13.85μg/g FW，表明釀酒酵母菌為藥用植物中的皂苷異源代謝合成提供了天然的表達系統(tǒng)，也為通過代謝工程手段實現(xiàn)皂苷的異源工業(yè)化生產(chǎn)提供了研究思路。1.2 釀酒酵母基因工程菌競爭途徑的調(diào)控 當外源途徑在釀酒酵母底盤細胞中成功組合、表達后，目的產(chǎn)物的合成依然還受酵母內(nèi)源代謝途徑的干擾，因此對于酵母內(nèi)源競爭途徑的調(diào)控顯得十分重要。

張根林[10]對β-香樹脂醇的研究報道中指出，除了存在MVA途徑下游的FPP、鯊烯分支代謝外，至少還存在兩個競爭代謝分支，一個是維持細胞正常生長必需的甾醇合成途徑，一個是胞質(zhì)乙酰輔酶A的合成與代謝途徑。所以張根林在釀酒酵母中構(gòu)建了β-香樹脂醇的合成途徑后，通過下調(diào)競爭β-香樹脂醇合成的內(nèi)源甾醇和乙酰輔酶A的代謝分流，用“推拉式”措施優(yōu)化使得β-香樹脂醇的產(chǎn)量大幅提高。謝文平[17]構(gòu)建一種基于類胡蘿素顏色的啟動子強度表征系統(tǒng)，用于釀酒酵母中不同強度啟動子的表征，其中通過弱啟動子對競爭性代謝支路下調(diào)，以實現(xiàn)類胡蘿卜素的高產(chǎn)。

在異源宿主進行目的產(chǎn)物合成時，為提高目標途徑的代謝通量，增加前體物質(zhì)的產(chǎn)量也是關(guān)鍵之一。徐國強[18]為了提高延胡索酸的產(chǎn)量，首先敲除調(diào)控乙醇合成途徑中的關(guān)鍵基因，從而減少了乙醇的代謝通量獲得合成延胡索酸的大量丙酮酸前體物質(zhì)，并構(gòu)建了胞質(zhì)還原途徑，通過克隆釀酒酵母自身存在的丙酮酸羧化酶基因過表達延胡索酸。且利用基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型分析，通過敲除自身的關(guān)鍵基因，使得通過氧化途徑進一步積累延胡索酸。

2 釀酒酵母發(fā)酵工藝的優(yōu)化研究進展

微生物發(fā)酵優(yōu)化包括分子、細胞和反應(yīng)器三個層次，國內(nèi)外研究者通過代謝工程和合成生物技術(shù)構(gòu)建了釀酒酵母工程菌株，但為了獲得高產(chǎn)菌株，發(fā)酵過程的控制與優(yōu)化是實現(xiàn)代謝產(chǎn)物規(guī)?；a(chǎn)的必要環(huán)節(jié)[10]。而適宜的發(fā)酵條件必須包括以下幾點：①培養(yǎng)基應(yīng)具備一定的穩(wěn)定性且價格低廉；②在發(fā)酵培養(yǎng)基確定的情況下，適當調(diào)控釀酒酵母工程菌高密度發(fā)酵的重要參數(shù)，如接種量、溫度、pH值、通氣量等，可獲得高產(chǎn)目的代謝產(chǎn)物；③篩選最適合釀酒酵母工程菌培養(yǎng)的方式也是獲得高產(chǎn)菌株的關(guān)鍵因素之一。

2.1 釀酒酵母工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選 釀酒酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化的一方面是為了在優(yōu)化發(fā)酵條件后獲得高產(chǎn)的酵母工程菌，另一方面是為了實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵。優(yōu)化工藝首先是需要選擇適宜的培養(yǎng)基，最優(yōu)的培養(yǎng)基應(yīng)滿足在發(fā)酵過程中不會產(chǎn)生有毒代謝物質(zhì)，所產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物較少。同時應(yīng)具備一定的穩(wěn)定性，便于應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，并且需要保證不會因培養(yǎng)基自身原因影響目的代謝產(chǎn)物的提取和分離。對于培養(yǎng)基中的氮源、碳源、有機酸及金屬離子等因素的篩選也是優(yōu)化培養(yǎng)基的關(guān)鍵之一，當?shù)?、碳源的濃度過低或過高時均不利于目的產(chǎn)物的累積。施明雨[19]選用了無機鹽培養(yǎng)基為高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，同時限制了磷酸鹽的供給，在細胞生長對數(shù)期時添加有機萃取劑，使番茄紅素的產(chǎn)量提高了10.2倍，原人參二醇產(chǎn)量提高了10.5倍。王冬[20]通過對YDP培養(yǎng)基的初糖濃度進行優(yōu)化研究，表明在葡萄糖濃度為40 g/L時可獲得最高生物量，而當其濃度超過此濃度后會受到發(fā)酵過程積累的高濃度乙醇抑制，從而影響工程菌的生長及目標產(chǎn)物的合成。所以對于成功的釀酒酵母工程菌的發(fā)酵，培養(yǎng)基的優(yōu)化是十分關(guān)鍵的。

2.2 釀酒酵母工程菌發(fā)酵重要參數(shù)的優(yōu)化 影響釀酒酵母工程菌高密度發(fā)酵的因素很多，如培養(yǎng)溫度、pH值、通氣量、接種量、轉(zhuǎn)速、搖瓶發(fā)酵時間等，在發(fā)酵培養(yǎng)基確定的情況下，適當?shù)恼{(diào)整這些因素可獲得較高產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物。劉志友[21]通過對番茄果酒主要影響因子如初始糖度、酵母接種量、pH和溫度進行了正交優(yōu)化試驗，結(jié)果獲得了達到果酒感官理化衛(wèi)生標準的番茄果酒。

2.3 釀酒酵母工程菌培養(yǎng)方式的篩選 目前細胞高密度培養(yǎng)方式主要有細胞循環(huán)培養(yǎng)和透析培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)等，其中，補料分批培養(yǎng)對生長偶聯(lián)產(chǎn)品和胞內(nèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)有很大的幫助。對于補料分批培養(yǎng)的研究是實現(xiàn)自動化控制的前提[19]。張根林[10]使用乙醇補料批式發(fā)酵，使得β-香樹脂醇的產(chǎn)量提高了90.2%。

3 存在的問題和展望

盡管國內(nèi)外學者在釀酒酵母底盤細胞中構(gòu)建了許多工程菌，并成功表達外源蛋白且獲得高產(chǎn)菌株，但依然存在一些問題值得深思：①依然存在部分外源基因不能在釀酒酵母表達系統(tǒng)中表達，而具體原因尚未明確；②對于較長途徑中的表達效率較低；③沒有徹底克服產(chǎn)物蛋白不均一的現(xiàn)象；④對于發(fā)酵過程中，有關(guān)釀酒酵母自身的乙醇耐性、耐低溫、耐高滲等耐受性的機理還尚不清楚，有待研究。

為成功構(gòu)建代謝途徑并能在細胞中穩(wěn)定遺傳，可通過從動植物中克隆代謝途徑中的多個關(guān)鍵酶基因，不再是單一的啟動子-基因-終止子組成的表達盒導入釀酒酵母細胞中進行基因的過表達，而是通過調(diào)控多個目標酶的催化效率從而獲得穩(wěn)定遺傳的工程菌株。另外，目前已有關(guān)于優(yōu)化密碼子的研究報道[16]，未來可通過優(yōu)化密碼子影響代謝途徑從而提高外源酶基因在釀酒酵母工程菌中的表達效率。而關(guān)于釀酒酵母自身耐受性研究報道，目前主要集中在乙醇耐受性，已發(fā)現(xiàn)細胞壁、細胞膜等細胞結(jié)構(gòu)與乙醇的耐受性有關(guān)[22-23]，且通過對釀酒酵母非必需基因的敲除可提高乙醇的耐受性[24]。因此可通過加強對細胞代謝工程、基因組學以及蛋白組學的研究，從而獲取更多相關(guān)基因信息，為各種耐受性的機理研究奠定基礎(chǔ)。

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(編輯：梁志慶)

Current progress on the construction and optimization of genetically engineeredSaccharomycescerevisiae

LI Yuan ZHANG Aili ZHOU Wei QIAN Zigang*

Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants, Yunnan University of Traditional, Chinese Medicine, Kunming 650500, China

Saccharomycescerevisiaeis an important heterologous host for the synthesis of natural products. However, the construction of genetically stable, high-yielding strains ofS.cerevisiaewith controllable metabolic pathways remains a significant challenge in synthetic biology. In this review, we provide an overview of the current progress on the construction of genetically engineered S. cerevisiae and the optimization of fermentation conditions,to prouide a reference for its metavolism and synthesis.

SaccharomycesCerevisiae; Expression System Construction; Fermentation Optimization; Synthetic Biology

2016-08-23

國家自然科學基金(NO: 81260609)；云南省教育廳重點項目(NO: 2015119)；云南省教育廳科學研究基金項目(NO:2015J101)。

李媛(1991-)，女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為中藥資源開發(fā)與利用。E-mail:365408783@qq.com

錢子剛(1962-)，男,漢族,教授,碩士生導師。E-mail: qianzig@ailiyun.com

R714

A

1007-8517(2016)18-0005-03