焦興蘋 昝 珂 過立農(nóng) 鄭 健 馬雙成

1.青海省藥品檢驗(yàn)檢測院，青海 西寧 810000；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

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綠原酸等四種物質(zhì)采用不同進(jìn)樣方法制訂HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

焦興蘋 昝 珂 過立農(nóng) 鄭 健 馬雙成

1.青海省藥品檢驗(yàn)檢測院，青海 西寧 810000；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

目的：比較高效液相色譜法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，對照品稀釋法和不同進(jìn)樣量法的異同。方法：采用高效液相色譜法，以綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對照品作為研究對象，采用對照品稀釋法和進(jìn)樣不同體積法，測定峰面積，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：木犀草苷兩種方法結(jié)果線性關(guān)系良好，而綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷僅稀釋法線性關(guān)系良好。結(jié)論：建議采用稀釋法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同進(jìn)樣量法需慎重。

高效液相色譜法；線性；對照品稀釋法；不同進(jìn)樣量法

在建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證；在藥品生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需進(jìn)行驗(yàn)證。線性是藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證的必需項(xiàng)目之一[1]。在建立中藥含量測定方法時，高效液相色譜法是最常采用的方法。常用的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法有兩種，一是配置一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以峰面積對被測物質(zhì)濃度進(jìn)行線性擬合[2-8]；另外一種方法是同一對照品溶液，進(jìn)樣不同體積，以峰面積對被測物質(zhì)進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸計(jì)算[9-15]。本研究采用綠原酸(1)、連翹酯苷B(2)、毛蕊花糖苷(3)、木犀草苷(4)四個對照品(結(jié)構(gòu)式見圖1)按上述兩種線性制作方法進(jìn)行試驗(yàn)，比較二者的異同。結(jié)果顯示，4個對照品溶液按照對照品稀釋法試驗(yàn)，線性關(guān)系均良好；采用不同進(jìn)樣量法試驗(yàn)，僅木犀草苷線性關(guān)系良好，綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷三個化合物隨進(jìn)樣量增大，峰面積響應(yīng)值偏低，線性關(guān)系呈類拋物線型。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器，二元泵，自動進(jìn)樣器，脫氣機(jī))；MSA125P型電子天平(賽多利斯)。1.2 材料 綠原酸對照品(批號：110753-201314)、連翹酯苷B(批號：111811-201102)、木犀草苷(批號：111720-201408)購自中國食品藥品檢定研究院；毛蕊花糖苷(批號：M-011-150318北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司)。磷酸(批號20140305，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甲醇和乙腈為色譜純(Fisher公司)，水為Milli-Q超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XSelect HSS T3(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-0.5%磷酸溶液 (18∶82)；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：332nm。

2.2 對照品溶液的配制 分別取綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對照品約10mg，精密稱定，分別置于10mL棕色量瓶中，以乙腈溶解并定容至10mL，即得各對照品儲備液。分別吸取上述儲備液0.1、0.2、0.3、0.5、0.8mL分別置于25mL容量瓶中，用流動相稀釋至25mL，用0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得對照品溶液濃度分別約為4、8、12、20、32μg/mL。

2.3 不同進(jìn)樣量法試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下對照品混合溶液(20μg/mL)，分別進(jìn)樣1、 2、 5、 10 、15μL，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，線性圖見圖2。

表1 對照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

結(jié)果表明，不同進(jìn)樣量法測定的木犀草苷線性關(guān)系良好，而綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷三個成分隨進(jìn)樣量增大，響應(yīng)值沒有線性增加，呈類拋物線型。

2.3 對照品稀釋法測定線性 分別精密吸取上述2.2項(xiàng)下一系列濃度的對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，以各對照品進(jìn)樣量(μg)為X軸，以峰面積積分值為Y軸，進(jìn)行線性回歸，各對照品回歸方程和線性范圍見表2，線性圖見圖3。

表2 對照品稀釋法制訂標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

結(jié)果表明，采用對照品稀釋法，所測四個成分線性關(guān)系均良好。

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，以綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷以及木犀草苷四個對照品為研究對象，通過對照品稀釋法和進(jìn)樣不同體積法對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證中的線性進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，采用對照品稀釋法，四個化合物的線性關(guān)系均良好，采用進(jìn)樣不同體積法僅木犀草苷的線性關(guān)系良好，而綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷三個成分隨進(jìn)樣量增大，峰面積響應(yīng)值沒有線性增加，呈類拋物線型。其原因可能是流動相中加入了磷酸溶液，對照品溶液為甲醇配制，隨著進(jìn)樣量增大，注入的不同體積的對照品溶液對流動相的pH值造成了波動。

綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中均含有咖啡酸酯類，在含水量較高的流動相中容易產(chǎn)生電離，使色譜峰拖尾變寬，加入磷酸等酸性抑制劑抑制了此類化合物的電離，改善色譜峰的峰形。流動相不同pH值對化合物的峰形具有顯著影響，導(dǎo)致峰面積不完全成線性關(guān)系[16]。而進(jìn)樣相同體積不同濃度的對照品溶液對流動相pH值的影響是一致的，峰面積和濃度呈線性關(guān)系。

由于本實(shí)驗(yàn)儀器是采用自動進(jìn)樣，木犀草苷的線性均良好，表明進(jìn)樣器準(zhǔn)確性和性能良好。實(shí)驗(yàn)選用的進(jìn)樣量范圍1～15μL為常用進(jìn)樣量范圍，進(jìn)樣體積并不過大。由于不同進(jìn)樣量法較為簡便，課題組先采用不同進(jìn)樣量法進(jìn)行線性試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果均與本文報(bào)道一致，綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷3個化合物線性不佳，后改用稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)，線性良好。

因此，進(jìn)行中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證時，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備一般應(yīng)采用稀釋法進(jìn)行，慎重使用不同進(jìn)樣體積法。

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(編輯：梁志慶)

Comparison of Four Different Chlorogenic Acid and Other Substances with Different Injection Methods to Develop HPLC Standard Curve

JIAO Xingping1ZAN Ke2GUO Linong2ZHENG Jian2*MA Shuangcheng2

1.Qinghai Provincial Institutes For Drug Control, Xining 810000，China;2.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050,China

Object To compare differences and similarities of two injection methods for establishing calibration curves by HPLC. Methods To determine peak area and calculate calibration curves of chlorogenic acid, forsythoside B, acteoside and luteoloside by dilution and injection volume. Results Both of two methods of calibration curves are good for luteoloside. However, only dilution method can meet requirement for chlorogenic acid, forsythoside B and acteoside. Conclution Dilution method is suggested to establish calibration curves, injection volume method is suggested to use prudently.

HPLC; Calibration Curve;

ubstance Dilution Method; Injection Volume Method

2016-06-27

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)“中藥飲片質(zhì)量保障系統(tǒng)研究(一)”資助，項(xiàng)目編號：201507002；國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥化注冊司專項(xiàng)資助。

焦興蘋(1988-)，女，藏族，本科，中藥師，研究方向?yàn)橹胁厮帯-mail：492076532@qq.com

鄭健(1971-)，女，博士，研究員，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail：bjzj825@163.com

R914.1

A

1007-8517(2016)18-0013-04