張立偉（遼陽市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 遼陽 111000）

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2014年某市麻疹檢測結(jié)果的分析

張立偉
（遼陽市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 遼陽 111000）

【摘要】目的 分析2014年遼陽市麻疹實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，了解遼陽麻疹的流行狀況、野毒株基因型特征，為我市麻疹防控提供科學(xué)依據(jù)。方法 采集疑似麻疹病例的血清標(biāo)本690份，進(jìn)行麻疹I(lǐng)gM抗體檢測；56份咽拭子標(biāo)本，提取核酸后進(jìn)行PCR檢測；核酸陽性的樣品進(jìn)行基因分型檢測。結(jié)果 690份血清標(biāo)本中IgM抗體陽性467份，陽性率67.68%；56份咽拭子標(biāo)本PCR陽性45份，陽性率80.36%；基因型為H1a。結(jié)論 2014年遼陽市麻疹暴發(fā)流行，以基因型H1a為主，與全國的流行趨勢基本相同。

【關(guān)鍵詞】麻疹病毒；IgM抗體檢測；核酸檢測；麻疹病毒基因分型

麻疹是嚴(yán)重威脅我國人群健康的傳染病，該病毒屬副黏病毒科麻疹病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒。麻疹病毒只有一個(gè)血清型，有多個(gè)基因型，截至2005年，已發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因組（A～H），22個(gè)基因型（A、B1～B3、C1、C2、D1～D9、E、F、G1～G3、H1、H2）在世界各地流行。我國以H1基因型為優(yōu)勢流行基因型，其中又以H1a為主要的流行亞型[1]。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源：2014年遼陽市疾控中心共收集散發(fā)及暴發(fā)的麻疹疑似病例血清標(biāo)本690份，咽拭子標(biāo)本56份。血清標(biāo)本-20 ℃保存，咽拭子標(biāo)本-70 ℃保存。

1.2 儀器和試劑：麻疹I(lǐng)gM抗體檢測試劑由德國維潤賽潤研發(fā)有限公司生產(chǎn)提供；病毒RNA提取試劑由德國QIAGEN公司的Rneasy min Kit提取試劑；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑由江蘇碩世生物科技公司生產(chǎn)提供，試劑均在有效期內(nèi)使用。設(shè)備為瑞士帝肯Sunrise全自動(dòng)酶標(biāo)儀、伯樂IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 檢測方法

1.3.1 麻疹I(lǐng)gM抗體檢測嚴(yán)格按照德國維潤賽潤麻疹試劑的說明書操作，大于cutoff上限判定樣品為陽性，小于cutoff下限判定樣品為陰性。

1.3.2 病毒核酸檢測：使用real-time RT-PCR方法檢測，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。①反應(yīng)體系：RT-PCR反應(yīng)液7.5 μL、酶混合液5 μL、模板RNA 4 μL、無RNA酶水3.5 μL。②反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50 ℃，30 min；變性95 ℃，10 s，55 ℃，40 s，45個(gè)循環(huán)。③結(jié)果判斷：陰性結(jié)果Ct值>38或未檢出；陽性結(jié)果Ct值≤35；如35≤Ct值<38時(shí)，應(yīng)重復(fù)檢測。

1.3.3 病毒分離培養(yǎng)：病毒分離方法將處理好的標(biāo)本接種到長成單層的Vero/SLAM細(xì)胞上。每細(xì)胞瓶接種0.3 mL，37 ℃吸附1.5 h后加維持液進(jìn)行培養(yǎng)。逐日觀察細(xì)胞病變（CPE）和液體pH值變化情況。CPE達(dá)到75%～90%時(shí)將細(xì)胞瓶置于-80 ℃凍存以備傳代或鑒定。未發(fā)生CPE的繼續(xù)培養(yǎng)至第3代，仍無CPE則判為陰性[2]。Vero/SLAM細(xì)胞為國家麻疹實(shí)驗(yàn)室提供。①病毒分離物使用 Rneasy mini kit 試劑盒提取MEV的RNA。用 One-Step RT-PCR kit 擴(kuò)增MEV H和N基因，使用Quick Gel Extraction Kit對(duì)陽性產(chǎn)物進(jìn)行純化，以上試劑盒均由QIAGEN公司提供。RT-PCR反應(yīng)條件及引物序列參照文獻(xiàn)[3]。②基因序列測定和結(jié)果分析：將純化產(chǎn)物送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序。調(diào)出WHO MV 24個(gè)基因型的31個(gè)參考株序列，使用Sequencher4.0.5和MEGA 4.0.2軟件對(duì)這些參考株和本文分析的13株序列在N基因羧基末端的450個(gè)核苷酸的片段進(jìn)行核苷酸和氨基酸的變異比對(duì)分析（p-distance模型）和構(gòu)建進(jìn)化樹（鄰位-連接法，bootstrap檢驗(yàn)，抽樣次數(shù)500，Kimura-2 Parameter模型）[4]。

2 結(jié) 果

通過檢測發(fā)現(xiàn)，遼陽市690份血清標(biāo)本中IgM抗體陽性467份，陽性率67.68%；56份咽拭子標(biāo)本PCR陽性45份，陽性率80.36%；45份核酸陽性的咽拭子分離培養(yǎng)出11株毒株，將11株麻疹病毒N基因COOH末端450個(gè)核苷酸序列與WHO 24個(gè)基因型參考序列、中國1993年～1994年流行的H1基因亞型參考株和中國滬191疫苗株對(duì)應(yīng)序列做基因親緣性關(guān)系分析[5]。結(jié)果顯示，11株麻疹野病毒均為H1基因型的H1a基因亞型 。

3 討 論

麻疹病毒的基因組中，核蛋白（Nucleoprotein，N）基因和血凝素（Hemagglutinin，HA）基因是變異較大的基因，特別是核蛋白N基因羧基（COOH）末端450個(gè)核苷酸是麻疹病毒基因組中變異最大的區(qū)域，在不同的麻疹野毒株之間變異程度可達(dá)12%。故N基因是國際上公認(rèn)對(duì)麻疹毒株鑒定的重要指標(biāo)。我國自1995年起，經(jīng)20個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）連續(xù)8年的病毒學(xué)監(jiān)測證實(shí)Hl型是中國本土優(yōu)勢基因型，并將Hl基因型進(jìn)一步劃分為Hla、Hlb、Hlc基因亞型[6-10]。經(jīng)檢測遼陽市2014年的麻疹流行與全國的流行趨勢基本相同。

參考文獻(xiàn)

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中圖分類號(hào)：R511.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）09-0079-01