劉國(guó)生　李丹丹　鄭　晗　周　維　王曉亮　鄭建瓊

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，湖北　恩施　445000)

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鐵引起認(rèn)知相關(guān)缺損的機(jī)制及干預(yù)

劉國(guó)生李丹丹1鄭晗1周維王曉亮鄭建瓊

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，湖北恩施445000)

摘要〔〕目的探討老年性癡呆等神經(jīng)退行性疾病患者大腦中神經(jīng)元煙堿型膽堿能受體(nAchRs)的丟失是否與異常增高的腦鐵有關(guān)，以及鐵神經(jīng)毒性的作用機(jī)制，尋求預(yù)防途徑。方法建立鐵致神經(jīng)元損傷模型，采用TBARS，MTT,Annexin-V以及配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法，觀察PC12細(xì)胞在鐵侵害早期細(xì)胞損傷的機(jī)制及抗氧化劑的保護(hù)作用。結(jié)果硫酸亞鐵(FeSO4)在低濃度(1～100 μmol/L)范圍引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞毒性作用呈劑量依賴性增加，但不引起明顯可見的凋亡和壞死。與對(duì)照組比較，該濃度范圍可引起〔125I〕 α-Bungarotoxin結(jié)合位點(diǎn)明顯減少，但預(yù)先用抗氧化劑處理，可阻止鐵對(duì)〔125I〕 α-Bungarotoxin的親和力。結(jié)論鐵誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，能降低〔125I〕 α-Bungarotoxin結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量，這些改變發(fā)生在PC12細(xì)胞損害早期階段。鐵與氧化應(yīng)激對(duì)nAchRs的損傷可早于凋亡和壞死的過(guò)程，可能發(fā)生在神經(jīng)退行性病程的早期。直接降低腦鐵濃度及抑制活性氧化物質(zhì)的產(chǎn)生應(yīng)是預(yù)防和治療認(rèn)知缺損相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)方向。

關(guān)鍵詞〔〕煙堿型膽堿能；老年性癡呆；鐵氧化應(yīng)激

1湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

第一作者：劉國(guó)生(1982-)，男，主管檢驗(yàn)師，碩士在讀，主要從事臨床檢驗(yàn)研究。

神經(jīng)元煙堿型膽堿能受體(nAchRs)在大腦認(rèn)知功能中起主要作用〔1,2〕。值得注意的是在一些中樞神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(AD),帕金森病(PD)和精神分裂癥患者中nAchRs功能缺乏，含nAchRs的神經(jīng)元大量丟失是這些疾病的主要病因之一，尤其是AD其臨床表現(xiàn)主要為記憶力進(jìn)行性減退和認(rèn)知功能障礙，中樞膽堿能系統(tǒng)功能減退發(fā)生最早，最明顯〔3〕。但迄今為止nAchRs缺失的病因和發(fā)病機(jī)制，仍不清楚。近年來(lái)研究表明，腦鐵代謝異常，可引起許多腦部疾病。在AD、PD患者腦內(nèi)的基底神經(jīng)節(jié)和老年斑中，鐵含量異常增高,并存在氧化應(yīng)激狀態(tài)〔4,5〕。腦部鐵濃度升高可導(dǎo)致鐵氧化應(yīng)激和抗氧化保護(hù)機(jī)制的缺失，可能是神經(jīng)元變性死亡的原因之一。但關(guān)于鐵對(duì)nAchRs毒性作用的研究，在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究利用鐵作為誘導(dǎo)劑直接觀察早期神經(jīng)元損傷機(jī)制，以及抗氧化劑對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1材料MTT、(sigma公司)、硫巴比妥酸，硫酸亞鐵、維生素E(VitE)、還原型谷胱甘肽(GSH)購(gòu)于上海第六制藥廠。Annexin-V-Fluos 染色試劑盒購(gòu)于(Boehringer-Mannheim,德國(guó))。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)在含RPMI1640培養(yǎng)液，含2 mmol/L谷維素、10%滅活馬血清、5%小牛血清和2.5 μ/ml青-鏈霉素、培養(yǎng)皿預(yù)先涂有鼠尾膠，細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37℃含5%CO2濕氣培養(yǎng)箱中。

1.3抗氧化保護(hù)實(shí)驗(yàn)10 mmol/L硫酸亞鐵(FeSO4)儲(chǔ)備液含0.5% H2SO4維持溶液Fe2+狀態(tài)〔6〕。分別加入不同濃度FeSO4誘導(dǎo)處理PC12細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化96 h。培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)先用20 mmol/L VitE或2 mmol/L GSH處理細(xì)胞后，暴露于100 μmol/L FeSO4孵育96 h。

1.4硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)檢測(cè)用硫巴比妥酸反應(yīng)物檢測(cè)分析法〔7〕檢測(cè)培養(yǎng)液中丙二醛(MDA)含量。細(xì)胞并離心收集上清加入三氯醋酸(TCA)至4.5% TCA的混合，然后，加入兩體積的TBARS試劑(含0.45%TCA和12%醋酸)混合后，在90℃溫度孵育60 min，用波長(zhǎng)532 nm的光譜儀，檢測(cè)上清液中TBARS的含量。

1.5MTT遞減分析對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞鋪在96孔板內(nèi)細(xì)胞密度為5 000細(xì)胞/孔，加入10% 透析了的胎牛血清 ，次日換液，換入含不同鐵離子濃度的培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)96 h，每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT貯存液孵育4 h后，每孔加入100 μl溶液(20%SDS和50%二甲基亞砜(pp.8)過(guò)夜，570 nm波長(zhǎng)測(cè)得吸收率〔8〕。

1.6凋亡和壞死分析采用Annexin-V-FLUOS 染色試劑盒進(jìn)行凋亡和壞死分析實(shí)驗(yàn)，用FeSO4處理5×105對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞96 h后，置于100 μl標(biāo)記溶液，內(nèi)含1 μl Annexin-V(標(biāo)記凋亡)和1 μl PI標(biāo)記壞死。室溫下，孵育15 min，隨機(jī)性對(duì)照。但加入2 μmol/L Staurosporine孵育3 h誘導(dǎo)凋亡〔3〕，細(xì)胞用FACScan 流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.7〔125I〕 α-Bungarotoxin(α-BTX)配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)〔125I〕 α-BTX(260 Ci/mmol)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。粗膜制備，離心，取上清測(cè)定其蛋白含量，粗膜混懸液(100 μg)與2 nmol/L〔125I〕 α-BTX，25℃共同孵育30 min。清洗、離心，微管底部沉淀物在COBRA γ計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)(Packard Instrument,Meridian,CT)。另加入1 μmol/L放射性核素未標(biāo)記的α-BTX，確定非特異性結(jié)合力。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS10.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1TBARS變化加入不同濃度(10～1 000 μmol/L)FeSO4與PC12細(xì)胞共同孵育96 h后，TBARS量呈濃度依賴性遞增。見表1。

2.2細(xì)胞活性和神經(jīng)細(xì)胞毒性測(cè)定FeSO4處理96 h后，細(xì)胞活性明顯下降，隨FeSO4濃度呈依賴性遞減20%～80%。見表1。

2.3自由基誘導(dǎo)劑導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞凋亡或壞死的濃度測(cè)定將PC12細(xì)胞分別用不同濃度的FeSO4處理PC12細(xì)胞，當(dāng)FeSO4濃度低于200 μmol/L時(shí)，未檢測(cè)出凋亡細(xì)胞，而當(dāng)細(xì)胞暴露在高濃度500～1 000 μmol/L的FeSO4時(shí)，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞(表2)。自由基誘導(dǎo)劑引起細(xì)胞壞死，結(jié)果也與上述情況相同(表2)。Staurosporine已證明為凋亡誘導(dǎo)劑〔9〕。在本研究中作為陽(yáng)性對(duì)照。2 μmol/L Staurosporine處理PC12細(xì)胞3 h，明確誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不是壞死，也無(wú)脂質(zhì)過(guò)氧化，為一個(gè)可靠的檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡的方法。

表1　不同濃度FeSO4作用后的

表2　不同濃度FeSO4作用后細(xì)胞凋亡或壞死濃度的變化(%)

2.4FeSO4誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損害早期〔125I〕 α-Bungarotoxin(αBTX)結(jié)合位點(diǎn)的變化與對(duì)照組(27.01 fmol/mg)比較，100 μmol/L FeSO4處理后的PC12細(xì)胞其〔125I〕 α-Bungarotoxin(α-BTX)結(jié)合位點(diǎn)下降33%(18.11 fmol/mg,P<0.05),1 μmol/L FeSO4和10 μmol/L FeSO4處理組分別下降6%(25.39 fmol/ml)和15%(22.96 fmol/mg)，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異P>0.05〕，而單獨(dú)用VitE和GSH處理PC12細(xì)胞，其〔125I〕 α-Bungarotoxin(αBTX)結(jié)合力未見改變(資料未提供)然而，預(yù)先用VitE和GSH分別處理PC12細(xì)胞可以干預(yù)其誘導(dǎo)的〔125I〕 α-Bungarotoxin(αBTX)結(jié)合位點(diǎn)的下調(diào)，其中對(duì)照組結(jié)合焦點(diǎn)為27.01 fmol/mg，單獨(dú)FeSO4結(jié)合位點(diǎn)為14.03 fmol/mg，預(yù)先Vit E、GSH分別處理后為25.61、22.76 fmol/mg。

3討論

腦組織是體內(nèi)氧負(fù)荷最大的器官，氧化應(yīng)激、自由基產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)失衡是導(dǎo)致AD、PD的原因之一。

鐵的致氧化損傷作用愈來(lái)愈引起人們的關(guān)注。正常情況鐵分布于整個(gè)腦組織中，但其分布不均勻?；咨窠?jīng)節(jié)中含量最高并隨年齡增加，對(duì)腦組織功能活動(dòng)極為重要。鐵是電子傳遞者，是線粒體氧化和氧運(yùn)輸不可缺少的物質(zhì)，腦鐵代謝平衡對(duì)維持正常腦功能尤其是認(rèn)知功能必不可少。近年來(lái)研究顯示AD等基底神經(jīng)節(jié)疾病鐵沉積增多,腦組織氧化損傷程度與局部腦鐵直接相關(guān)〔10〕，這種腦鐵的增加是否是疾病的起因,一直未有定論。

本研究表明細(xì)胞膜對(duì)鐵的致氧化損傷十分敏感,與有關(guān)腦鐵代謝紊亂是一些中樞退行性疾病的始發(fā)因素的觀點(diǎn)一致。通過(guò)與過(guò)氧化氫和氧的反應(yīng)，游離鐵可引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞膜的損傷最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔6〕。MDA水平反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度，本研究條件下，培養(yǎng)的細(xì)胞暴露在10～100 μmol/L FeSO4中96 h，MDA水平是濃度依賴性遞增，MTT分析細(xì)胞死亡率亦呈濃度依賴性遞減。

在PC12細(xì)胞MTT降解率下降是自由基誘導(dǎo)損害的一個(gè)早期特異性指征〔7〕。細(xì)胞死亡經(jīng)由凋亡或壞死，細(xì)胞膜磷脂倒置是鑒別神經(jīng)元凋亡初期的改變〔8〕。本研究結(jié)果表明游離鐵暴露致細(xì)胞膜磷脂發(fā)生倒置，但只有較高濃度的鐵離子(500～1 000 μmol/L)才引起細(xì)胞早期凋亡與Kruman等〔8〕結(jié)果一致，500 μmol/L以上才出現(xiàn)細(xì)胞壞死。與凋亡、壞死相比，PC12細(xì)胞暴露較低濃度(1～200 μmol/L)FeSO4也能引起MTT下降，表明MTT分析可作為檢測(cè)早于凋亡、壞死發(fā)生之前細(xì)胞損害的敏感性指標(biāo)。更重要的是，它可作為自由基損害nAchRs早期相對(duì)特異性的改變，而不是晚期的死亡，由此，揭示了氧自由基引起nAchRs缺損的一個(gè)可能機(jī)制〔11〕。因此，本研究用低濃度自由基誘導(dǎo)劑FeSO4處理細(xì)胞，早在細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死之前，觀察鐵對(duì)nAchRs的損害機(jī)制。

細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化將導(dǎo)致膜完整性破壞，多不飽和脂肪酸鏈對(duì)于維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性是必不可少的，而這些脂肪酸過(guò)氧化將增加細(xì)胞膜的僵硬程度，由此降低膜受體的活動(dòng)度。而腦中受體周圍脂質(zhì)環(huán)境可能對(duì)自由基更敏感〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示培養(yǎng)的PC12 細(xì)胞的〔125I〕 α-Bungarotoxin(α-BTX)和〔3H〕epibatidine結(jié)合力下降是由于脂質(zhì)過(guò)氧化環(huán)境引起的nAchRs受體早期損害，而不是瀕死細(xì)胞的最終結(jié)果。如果預(yù)先用抗氧化劑處理，可抑制結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量的降低，進(jìn)一步支持這一觀點(diǎn)。在AD病人腦中N受體的缺損近來(lái)引起愈來(lái)愈多的關(guān)注，α7亞單位在海馬、皮質(zhì)高密度分布，它們能夠形成同源性單聚體型煙堿受體亞型，明顯參與幾種學(xué)習(xí)記憶行為〔13〕。

因腦組織中氧利用率高，細(xì)胞膜含有豐富的對(duì)氧自由基敏感的多聚不飽和脂肪酸，更易遭受自由基介導(dǎo)的損害。與正常衰老組織比較，AD患者腦中海馬、杏仁核、Maynert基底核以及大腦皮層中鐵水平升高，腦組織中自由基產(chǎn)生也增加，而在AD大腦中，nAchRs的大量缺失主要發(fā)生在基底前腦、皮質(zhì)、海馬。有資料證明抗氧化劑，如Vit E 可保護(hù)神經(jīng)元免受氧自由基的損害，減緩AD病程〔14〕。本研究結(jié)果同樣也證實(shí)Vit E和還原型谷胱甘肽可保護(hù)鐵誘導(dǎo)的nAchRs的缺損，由此提示，鐵自由基對(duì)細(xì)胞膜的攻擊可能是nAchRs缺損的一個(gè)機(jī)制。盡管氧化應(yīng)激不是特定因素，但可能是nAchRs結(jié)構(gòu)功能改變的主要原因。進(jìn)一步探討鐵對(duì)腦的功能影響的可能途徑及抗氧化劑的干預(yù)作用是今后研究AD等神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)方向。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者：李丹丹(1987-)，女，護(hù)師，主要從事臨床神經(jīng)退行性疾病護(hù)理研究。

中圖分類號(hào)〔〕R749〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6070-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.028