林振呂　張　琳　鄭建濤

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診外科，福建　福州　350005)

?

miR-215對胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機制

林振呂張琳鄭建濤1

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診外科，福建福州350005)

摘要〔〕目的探討miR-215對胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及作用機制。方法通過RT-PCR檢測miR-215在高轉(zhuǎn)移胃癌細胞株NCI-N87，BGC-823，RF-48及低轉(zhuǎn)移細胞株HGC-27及MKN-28中的表達；Transwell遷移及侵襲實驗檢測miR-215抑制劑對胃癌細胞遷移及侵襲能力的影響；Western印跡檢測miR-215抑制劑對胃癌細胞活化白細胞黏附分子(ALCAM)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2，MMP-9，上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-鈣黏附素(E-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)表達量的影響。結(jié)果RT-PCR結(jié)果證實miR-215在高轉(zhuǎn)移胃癌細胞株中的表達高于低轉(zhuǎn)移胃癌細胞中的表達，且miR-215在BGC-823細胞中的表達最高，因此選用BGC-823作為后續(xù)實驗細胞株。miR-215抑制劑轉(zhuǎn)染BGC-823細胞48 h后，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-215表達能顯著抑制BGC-823細胞遷移及侵襲能力，并能下調(diào)ALCAM，MMP-2，MMP-9及Vimentin表達，上調(diào)E-cadherin表達。結(jié)論miR-215低表達能顯著抑制胃癌細胞BGC-823侵襲及轉(zhuǎn)移能力，與下調(diào)MMPs及抑制EMT生成有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕miR-215；胃癌細胞；侵襲；轉(zhuǎn)移

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科

第一作者：林振呂(1968-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事普外科研究。

隨著外科手術(shù)水平，生物治療及化療放療手段的提高，胃癌患者的治愈率大大提高，但是5年生存率不足30%，主要原因是腫瘤組織的侵襲轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后不良〔1,2〕。同時胃癌早期癥狀不易發(fā)現(xiàn)或無任何癥狀，因此，常導(dǎo)致診斷被延誤。所以探索高敏感性，高特異性的腫瘤標志物，對于胃癌的診斷及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機制的研究具有重要意義。大量的實驗研究證實，miRNA與腫瘤的增殖，凋亡，分化，侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在人類腫瘤包括胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔3,4〕。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)miR-215在胃癌組織中表達異常，如Jin等〔5〕通過miRNA芯片技術(shù)及實時熒光定量-PCR證實miR-215在胃癌組織中的表達高于正常組織，且過表達miR-215可顯著促進胃癌細胞HFE145遷移。李良平等〔6〕發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中miR-215的含量高于健康對照者，提示miR-215的表達與胃癌的發(fā)生或發(fā)展有關(guān)。因此本文在此基礎(chǔ)上，進一步探討miR-215在不同轉(zhuǎn)移程度胃癌細胞株中的表達情況，從中選出miR-215表達量最高的胃癌細胞株，并探討miR-215對胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機制。

1材料和方法

1.1細胞株人胃癌細胞株NCI-N87，BGC-823，HGC-27購于中科院上海細胞庫，目錄號分別為：TCHu130，TCHu11，TCHu22；RF-48，MKN-28購自上海拜力生物科技有限公司；分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2試劑及儀器四唑鹽試劑(MTT，Sigma公司)；兔抗基質(zhì)金屬蛋白(MMP)-2，MMP-9，E-鈣黏附素(E-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)， 活化白細胞黏附分子(ALCAM)，GADPH抗體(Epitmics公司)；Transwell 小室(Corning 公司)；結(jié)晶紫(Sigma公司)；miR-215抑制劑，miR-215 NC(上海吉瑪制藥公司)。倒置顯微鏡(Nikon公司)；流式細胞儀(BD 公司)；迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀，ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.3RT-PCR檢測miR-215在胃癌細胞株中的表達總RNA的提取參考Trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說明書，整個提取處于無RNAase的環(huán)境下。引物設(shè)計如下，miR-215上游引物：5'-CTCGAGATGTCATCCTCAG-3'，下游引物：5'GAATTCGTGAGTTCTTCTG-3'。 GAPDH作為內(nèi)參標記物，上游引物：5'- AATCCCATCACCATCTTCCA-3'，下游引物5'- CCTGCTTCAACCACCTTCTTG-3'。通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進行PCR擴增，獲取 5 μl擴增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖膠進行檢測。

1.4遷移實驗將BGC-823接種于96孔板，當細胞匯合度達到50%時，轉(zhuǎn)染miR-215抑制劑和對照NC，轉(zhuǎn)染達到48 h后，將細胞消化加入Transwell上室，下室用含 5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，洗滌，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，被染色的細胞漿呈紫色，倒置光學(xué)顯微鏡下計數(shù)5個視野遷移細胞個數(shù)，計算平均每個視野的細胞數(shù)，即表示細胞的遷移能力。

1.5侵襲實驗將 Matrigel 膠均勻平鋪于Transwell 小室的微膜(8 μm)上，制成凝膠備用。后按1.4方法進行操作，最后倒置光學(xué)顯微鏡下計數(shù)5個視野穿膜細胞個數(shù)，計算平均每個視野的細胞數(shù)，即表示細胞的侵襲能力。

1.6Western印跡當細胞匯合度達到50%時，轉(zhuǎn)miR-215和對應(yīng)的對照NC，轉(zhuǎn)染達到48 h后，轉(zhuǎn)染達到48 h后，刮下細胞，離心，后加入適量的RIPA裂解液，每隔10 min置于渦旋儀中震蕩30 s，40 min后，4℃，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。將膜浸入一抗溶液孵育，4℃過夜；漂洗后，浸入二抗溶液中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進行統(tǒng)計。

1.7數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2結(jié)果

2.1miR-215在5株胃癌癌細胞株中的表達通過RT-PCR和檢測發(fā)現(xiàn)miR-215在RF-48、NCI-N87、BGC-823高轉(zhuǎn)移胃癌細胞株中的表達量〔(2.30±0.22)，(2.54±0.14)，(3.22±0.25)〕高于MKN-28、HGC-27低轉(zhuǎn)移胃癌細胞株中的表達量〔(1.01±0.21)、(1.31±0.20)〕，且在BGC-823中miR-215表達量最高，因此作為后續(xù)實驗的細胞株。

2.2miR-215抑制劑對BGC-823細胞遷移和侵襲能力的影響如圖1，圖2所示，抑制劑及NC轉(zhuǎn)染48 h后，與NC組比較，miR-215抑制劑能顯著抑制BGC-823細胞遷移能力〔(99.05%±7.43%)vs(48.32%±5.38%)〕及侵襲能力〔(99.98%±8.12%)vs(55.45%±6.07%)〕(P<0.01)。

圖1　miR-215抑制劑對BGC-823細胞遷移能力的影響

圖2　miR-215抑制劑對BGC-823細胞侵襲能力的影響

2.3miR-215抑制劑對BGC-823細胞中ALCAM表達量的影響如圖3所示，與NC組(1.25±0.14)比較，miR-215抑制劑(0.34±0.05)能顯著抑制BGC-823細胞中ALCAM的表達(P<0.01)。

圖3　miR-215抑制劑對BGC-823細胞中ALCAM表達量的影響

2.4miR-215抑制劑對BGC-823細胞中MMPs表達量的影響如圖4，表1所示，與NC組比較，miR-215抑制劑能顯著抑制BGC-823細胞中MMP-2及MMP-9的表達(P<0.01)。

圖4　miR-215抑制劑對BGC-823細胞中MMPs表達量的影響

2.5miR-215抑制劑對BGC-823細胞中E-cadherin及Vimentin表達量的影響如圖5及表1示，與NC組比較，miR-215抑制劑能顯著抑制BGC-823細胞中Vimentin的表達，促進E-cadherin的表達(P<0.01)。

圖5　miR-215抑制劑對BGC-823細胞中E-cadherin及Vimentin表達量的影響

組別MMP2/GADPHMMP9/GADPHE-cadherinGADPHVimentin/GADPHNC組1.29±0.140.88±0.080.37±0.041.05±0.10miR-215抑制劑組0.33±0.011)0.42±0.041)0.99±0.081)0.32±0.031)

與NC組比較：1)P<0.01

3討論

miRNAs是一類進化上高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，由21～23個氨基酸組成，它能夠結(jié)合于靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)域，阻遏靶基因的翻譯，從而調(diào)控靶基因表達，參與多種疾病的病理生理過程。miR-215定位于人染色體1q41，在胃癌組織或血清中高表達，并通過調(diào)節(jié)靶基因的表達水平影響胃癌細胞的增殖遷移能力〔5〕。因此本研究在此基礎(chǔ)上，通過RT-PCR進一步檢測miR-215在不同轉(zhuǎn)移程度胃癌細胞株中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移胃癌細胞株中miR-215的表達高于低轉(zhuǎn)移程度胃癌細胞株，且下調(diào)miR-215能顯著的抑制BGC-823細胞的遷移侵襲能力，但具體機制未知。而先前Jin等〔5〕，周志威等〔7〕的研究報道證實ALCAM是miR-215的靶分子之一，且ALCAM在胃癌組織中表達異常。ALCAM是一種廣泛存在于人體各組織器官中的糖蛋白，能通過介導(dǎo)同嗜性黏附或異嗜性作用介導(dǎo)細胞間的黏附，從而影響細胞運動狀態(tài)。細胞的運動性增加可顯著促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，通過下調(diào)ALCAM的表達量能一定程度上的抑制腫瘤細胞的遷移。

同時細胞外基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的必要步驟，MMPs是降解細胞外基質(zhì)的最重要的蛋白水解酶，在細胞腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMP-2不僅可以降解細胞外基質(zhì)中的明膠Ⅳ型膠原等，有利于腫瘤細胞沿著受損的基底膜向周圍浸潤，還可以通過新生毛細血管促進腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，是惡性腫瘤浸潤和侵襲的標志〔8〕。MMP-9是由多種細胞分泌的一種蛋白水解酶，是MMPs中分子量最大的酶，能夠降解細胞外基質(zhì)和基底膜，從而增加細胞的運動能力，促進腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移。MMPs在腫瘤細胞的侵襲過程中起到至關(guān)重要的影響。陳進等〔9〕發(fā)現(xiàn)MMP-2在胃癌組織中的表達率為75%，MMP-9在胃癌組織中的表達率為68.3%，均顯著高于周圍正常組織。孫述臣等〔10〕通過Northern印跡原位分子雜交ISH法證實胃癌組織中MMP2及MMP-9 mRNA的表達水平高于正常組織。臨床研究Meta分析也指出，MMP-9的高表達能夠增加胃癌組織的侵襲性，影響胃癌患者的預(yù)后〔11〕。因此通過下調(diào)胃癌細胞中MMPs的表達，能顯著抑制癌細胞的侵襲能力。

上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)最早在胚胎發(fā)育過程中得到證實，越來越多的證據(jù)表明EMT對腫瘤發(fā)生，包括局部浸潤和通過循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移和擴散起著重要作用，是侵襲能力最強的腫瘤細胞的特性，并且在惡性腫瘤細胞發(fā)生EMT時，可視為浸潤轉(zhuǎn)移的開始〔12,13〕。EMT的分子標志性特征為細胞間黏附分子E-cadherin的表達下調(diào)，一系列間充質(zhì)標記物的表達上調(diào)，包括N-cadherin，Vimentin和纖連蛋白。李德艷等〔14〕發(fā)現(xiàn)胃癌組織中E-cadherin表達陽性率為33.33%，明顯低于正常胃癌組織。熊德明等〔15〕證實Vimentin在胃癌組織中的陽性表達明顯高于正常組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能參與了EMT，在胃癌轉(zhuǎn)移過程起重要作用。因此通過抑制EMT的生成，也能顯著的抑制胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

本研究說明miR-215抑制劑可通過下調(diào)ALCAM及MMPs表達來抑制BGC-823細胞的遷移侵襲能力，顯著抑制EMT的生成，與上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)Vimentin表達有關(guān)。

參考文獻4

1Mahar AL,Mcleod RS,Kiss A,etal.A systematic review of the effect of institution and surgeon factors on surgical outcomes for gastric cancer〔J〕.J Am Coll Surg,2012;214(5):860-8.

2Mcguill MJ,Byrne P,Ravi N,etal.The prognostic impact of occult lymph node metastasis in cancer of the esophagus or esophago-gastric junction:systematic review and meta-analysis〔J〕.Dis Esophagus,2008;21(3):236-40.

3Kim CH,Kim HK,Rettig RL,etal.miRNA signature associated with outcome of gastric cancer patients following chemotherapy〔J〕.BMC Med Genomics,2011;4(1):79.

4Jankovic R,Radulovic S,Brankovic-Magic M.siRNA and miRNA for the treatment of cancer〔J〕.J BUON,2009;14(Suppl 1):S43-9.

5Jin Z,Selaru FM,Cheng Y,etal.MicroRNA-192 and-215 are upregulated in human gastric cancer in vivo and suppress ALCAM expression in vitro〔J〕.Oncogene,2011;30(13):1577-85.

6李良平，龍思澤，高采平.胃癌患者血清microRNA-192和microRNA-215的表達及臨床意義〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013；7(12)：5223-7.

7周志威，聶玉強，杜艷蕾，等.活化白細胞黏附分子在胃癌組織中的表達及其調(diào)控機制〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2013；34(18)：2784-8.

8Chang A,Parikh P,Thongprasert S,etal.Gefitinib (IRESSA) in patients of Asian origin with refractory advanced non-small cell lung cancer:subset analysis from the ISEL study〔J〕.J Thorac Oncol,2006;1(8):847-55.

9陳進，郭子健，王衛(wèi)理.MMP-2、MMP-9在胃癌組織中的表達及相關(guān)性分析〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010；30(5)：584-6.

10孫述臣，孫亞東，楊洋.胃癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物的基因表達意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2006；26(1)：40-1.

11Zhang QW,Liu L,Chen R,etal.Matrix metalloproteinase-9 as a prognostic factor in gastric cancer:a meta-analysis〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2012;13(6):2903-8.

12Yang JD,Nakamura I,Roberts LR.The tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma:current status and therapeutic targets〔J〕.Semin Cancer Biol,2011;21(1):35-43.

13Ogunwobi OO,Liu C.Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers:insights from experimental models〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol,2012;83(3):319-28.

14李德艷，劉愛東，高峰.MMP-7和E-cad在胃癌組織中表達的臨床價值〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011；31(2)：185-6.

15熊德明，張瑤，王國平，等.FOXC2和Vimentin蛋白在胃癌中的表達及意義〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2013；42(30)：3612-4.

〔2014-05-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：鄭建濤(1967-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸癌診治及基礎(chǔ)研究。

中圖分類號〔〕R73〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6064-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.026