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(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內二科,江西　贛州　341000)

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AngⅡ上調Th17/白細胞介素-17表達對兔動脈粥樣硬化形成的影響

謝家和謝東明廖祥中朱金海張古老

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內二科,江西贛州341000)

摘要〔〕目的觀察Th17/白細胞介素(IL)-17對兔動脈粥樣硬化形成的影響。方法通過導管球囊損傷動脈血管加高脂飼養(yǎng)的方法建立兔動脈粥樣硬化模型。22只新西蘭大白兔隨機分為正常對照組、高脂組、貝那普利組。飼養(yǎng)12 w后，檢查兔動脈粥樣斑塊的大小、血脂水平、血漿血管緊張素(Ang)Ⅱ、IL-17、超敏C-反應蛋白(hs-CRP)水平。結果成功建立起兔動脈粥樣硬化模型；高脂組、貝那普利組總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)及血漿AngⅡ、IL-17、hs-CRP表達水平明顯高于正常對照組(P<0.05)；貝那普利組血漿AngⅡ、IL-17、hs-CRP表達水平明顯低于高脂組(P<0.05)，血脂水平(TC、LDL-C、VLDL-C)表達沒有差異(P>0.05)，血漿AngⅡ與IL-17水平呈正相關(P<0.05)，血漿IL-17與hs-CRP水平呈正相關(P<0.05)。結論AngⅡ會促使動脈粥樣硬化的形成，其一個機制可能為AngⅡ上調Th17/ IL-17表達， Th17/ IL-17可能通過引起和加劇機體炎癥反應參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

關鍵詞〔〕血管緊張素(Ang)Ⅱ；動脈粥樣硬化；Th17/白細胞介素(IL)-17；超敏C-反應蛋白(hs-CRP)

第一作者：謝家和(1985-)，男,住院醫(yī)師,主要從事動脈粥樣硬化研究。

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病中最常見的疾病，嚴重危害人類尤其是老年人的健康，其導致心臟缺血、心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生〔1〕。研究報道，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在AS發(fā)生、發(fā)展中有重要作用〔2,3〕，對AngⅡ導致AS的發(fā)生確切機制尚未完全闡明。最近有研究報道，Th17/白細胞介素(IL)-17功能的異常與AS發(fā)生密切相關，但其對AS具體影響有一定爭議〔4,5〕，本文擬觀察Th17/IL-17在AS的表達及其是否介導AngⅡ參與AS的形成。

1材料和方法

1.1主要試劑AngⅡ放射免疫分析試劑盒購于北方生物技術研究所，貝那普利(北京諾華制藥有限公司)購于贛州市華爾康大藥房，IL-17、超敏C-反應蛋白(hs-CRP)酶聯免疫檢測試劑盒購于生工生物工程有限公司。

1.2實驗動物及飼料新西蘭雄性大白兔，體重(2.0±0.2)kg，3～4月兔齡，購于贛州畜牧研究所，合格證號：0000236；普通飼料購于贛州畜牧研究所，高脂飼料購于北京博泰宏達生物技術有限公司。

1.3兔AS模型新西蘭大白兔在適應性飼養(yǎng)1 w后行導管球囊(導管球囊來源于醫(yī)院廢棄導管球囊經消毒處理)損傷兔左側頸總動脈，具體操作參考文獻〔6〕介紹的方法同時給予高脂飼料飼養(yǎng)，高脂飼料配方參照于麗娜等〔7〕介紹的方法：1%膽固醇+5%豬油+10%蛋黃粉+84%普通飼料。飼養(yǎng)滿12 w后用超聲探查左側頸總動脈斑塊是否形成判斷模型成功與否的標志。

1.4實驗分組、飼養(yǎng)與給藥22只兔隨機分正常對照組6只，造模兔16只；造模兔行導管球囊損傷左側頸總動脈后，隨機分為高脂組，貝那普利組。①正常對照組，每只兔飼養(yǎng)普通飼料100 g/d，早晚各50 g。②高脂組，每只兔飼養(yǎng)高脂飼料100 g/d，早晚各50 g，并定時按2 mg ·kg-1·d-1行生理鹽水灌胃。③貝那普利組，每只兔飼養(yǎng)高脂飼料100 g/d，早晚各50 g，并定時按2 mg ·kg-1·d-1行貝那普利灌胃。

1.5造模成功后實驗兔的血漿、血清及組織的提取兔AS模型成功后，禁食不禁水24 h后，通過空氣栓塞處死兔，取右心房血裝入抗凝管、促凝管及AngⅡ專用管，30 min內離心，保存于-80℃冰箱用于做相關檢測，解剖兔主動脈、左頸動脈等組織、清洗后，保存于-80℃冰箱做相關檢測。血脂水平由我院檢驗科幫助完成；取兔主動脈粥樣硬化組織常規(guī)固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片的厚度約5 μm，做常規(guī)HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組兔動脈組織HE切片形態(tài)變化；血漿AngⅡ的檢測嚴格按照放射免疫分析試劑盒說明書操作步驟；血漿IL-17、hs-CRP的檢測嚴格按照酶聯免疫檢測試劑盒說明書操作步驟。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0軟件行t檢驗、單因素方差分析及SNK-q檢驗；相關性分析采用線性回歸相關性分析。

2結果

2.1各組實驗兔主動脈內膜組織肉眼觀及HE病理切片觀察正常對照組兔主動脈內膜肉眼觀為內膜光滑、平整、沒有油脂狀物質增生；高脂組兔主動脈內膜肉眼觀為內膜可見一層油脂狀物質，表面凹凸不平，突出管腔明顯；貝那普利組兔主動脈內膜肉眼觀為內膜可見一層油脂狀物質，表面凹凸不平，突出管腔，較高脂組比較，病變程度減輕。見圖1。正常對照組兔主動脈病理切片為內膜光滑，平整，無泡沫細胞；高脂組兔主動脈病理切片為內膜增生明顯，大量泡沫細胞堆積，膠原、鈣化及脂質沉積，斑塊破裂；貝那普利組兔主動脈病理切片為內膜增生明顯，膠原沉積、鈣化及脂質沉積，與高脂組比較，病變程度減輕。見圖2。

2.2血脂水平飼養(yǎng)12 w后檢測各組兔的血脂水平總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)，正常對照組、高脂組、貝那普利組血脂水平差異顯著(P<0.05)；高脂組和貝那普利組與正常對照組之間差異顯著(P<0.05)，見表1。

2.3血漿AngⅡ水平的表達正常對照組、高脂組、貝那普利組血漿AngⅡ差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見表1。

2.4血漿IL-17水平的表達正常對照組、高脂組、貝那普利組間血漿IL-17差異均顯著(P<0.05)，見表1。

2.5血漿hs-CRP水平的表達正常對照組、高脂組、貝那普利組之間血漿hs-CRP水平有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表1。

2.6血漿AngⅡ水平與IL-17水平的相關性血漿AngⅡ水平與IL-17水平呈正相關(r=0.79，P<0.05)。見圖3。

2.7血漿IL-17水平與hs-CRP水平相關性血漿IL-17水平與hs-CRP水平呈正相關(r=0.74,P<0.05)，見圖4。

圖1　各組兔主動脈內膜大體標本

圖2　各組兔主動脈內膜病理學觀察(HE，×200)

組別nTC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)VLDL-C(mmol/L)AngⅡ(pg/ml)IL-17(pg/ml)hs-CRP(pg/ml)正常對照組61.29±0.711.16±0.680.51±0.150.65±0.500.67±0.161238.32±125.6096.99±28.290.96±0.42高脂組829.1±1.861)5.89±5.911.19±2.6619.0±1.031)8.02±2.781)1554.38±32.231)221.50±36.541)21.91±5.021)貝那普利組828.7±1.501)6.64±5.692.42±2.4516.7±4.371)6.93±2.911)2)1419.76±32.781)157.05±41.681)2)13.23±4.021)2)

與正常對照組比較：1)P<0.05，與高脂組比較：2)P<0.05

圖3　血漿AngⅡ水平與IL-17水平相關性

圖4　血漿IL-17水平與hs-CRP水平相關性

3討論

Th17細胞是在研究自身免疫性疾病過程中逐漸被發(fā)現的一類新的效應性CD4+T細胞亞群，Th17細胞在IL-6、轉化生長因子(TGF)-B、IL-21、IL-23等因子作用下由初始CD4+T細胞分化而來〔8,9〕。Th17能夠分泌IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、 IL-17F、IL-22以及腫瘤壞死因子(TNF)-α等細胞因子，以分泌IL-17為特征，通常說IL-17一般指IL-17A，維甲酸相關核孤兒受體tγ(ROR-γt)是Th17細胞特異的轉錄因子，是控制Th17細胞分化的關鍵性轉錄因子。Th17細胞的功能主要體現在分泌因子IL-17上,IL-17的功能研究主要集中在IL-17A，其他的亞型研究很少〔10,11〕。IL-17是一個前炎性因子，其主要效應細胞為表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、淋巴細胞等。

本實驗結果推測，Th17/IL-17可能會促使AS形成。國外有報道，在AS ApoE(-/-)小鼠模型中，發(fā)現其動脈斑塊IL-17、 ROR-γt的mRNA水平與對照組有明顯升高，且Th17細胞增加的水平與斑塊的大小成正相關，中和性抗體IL-17Ab能減輕其斑塊的發(fā)展，并使斑塊更加穩(wěn)定〔12〕。在急性冠脈綜合征患者的外周血中Th17比例，IL-17的蛋白和 mRNA 水平都比健康對照組有明顯升高〔13〕。也有一些研究得出不一致的研究結果，有研究認為Th17/IL-17就有抗AS作用，Taleb等〔14〕研究發(fā)現小鼠中(SOCS-3)細胞因子3信號抑制物的失活增加了IL-17A和IL-10的產生，減少了自身免疫反應表型的巨噬細胞，進而減輕了炎癥反應及減少了斑塊的形成。導致各個研究之間差異的原因很多，可能與采血時間、試劑的廠家及使用方法等不同有關，而研究者也指出，IL-17 家族因子的作用可能依賴疾病所處的階段和是否處于活動期等因素有密切的關系〔15〕。目前有研究認為，Th17/IL-17可能通過NF-κB、MAPK信號途徑誘導下游IL-6、hs-CRP等炎性因子表達升高，參與AS的形成。IL-17 能通過NF-κB信號激活支氣管上皮細胞分泌IL-6、hs-CRP、CXCL-1,-2,-3,-5等炎性、趨化因子，引起和加劇機體炎癥反應，導致相關疾病的發(fā)生〔16〕。大量研究發(fā)現 IL-6、hs-CRP是AS形成的獨立危險因子，促使和加快AS形成。本實驗結果顯示高脂組hs-CRP水平最高，其次貝那普利組，正常對照組最低，通過對hs-CRP與IL-17相關性分析，hs-CRP與IL-17呈明顯正相關，差異有統(tǒng)計學意義，因此推測Th17/IL-17促動脈粥樣硬化的機制可能與增加hs-CRP等炎性物質表達有關。

AngⅡ與Th17/IL-17之間有密切關系，最近有研究報道，AngⅡ可以上調Th17/IL-17(一類新的效應性CD4+細胞亞群及其分泌因子)表達，給予不同劑量AngⅡ刺激健康人外周血單個核細胞后，Th17細胞比例上升，培養(yǎng)細胞ROR-γt mRNA(維甲酸相關核孤兒受體tγ,是控制Th17細胞分化的關鍵性轉錄因子) 表達增加，上清液IL-17水平顯著升高，且呈濃度依賴性〔17〕。本實驗結果顯示，高脂組AngⅡ、IL-17水平最高，其次貝那普利組，正常對照組最低。通過對AngⅡ與IL-17相對比值相關性分析，結果表明IL-17水平與AngⅡ水平相對比值成正相關。因此，本文推測AngⅡ可能通過上調Th17/IL-17表達引起IL-6、hs-CRP等炎性因子升高，參與AS的形成。這些研究結果對預防AS，防止其發(fā)生與發(fā)展，對防治心腦血管等疾病有一定意義。

參考文獻4

1李玉林.病理學〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:113-6.

2Fukui K,Yamada H,Matsubara H,etal.Pathophysiological role of tissue renin-angiotensin aldosterone system (RAAS) in human atherosclerosis 〔J〕.Nihon Rinsho,2012;70(9):1556-61.

3Hirata Y,Fukuda D,Sata M.Critical role of rennin-angiotensin system in the pathogenesis of atherosclerosis〔J〕.Nihon Rinsho,2011;69(1):55-9.

4Soraya Taleb,Alain Tedgui Ziad Mallat.Interleukin-17:friend or foe in atherosclerosis 〔J〕.Curr Opin Lipidol,2010;21(5):404-8.

5Dart ML,Jankowska-Gan E,Greenspan S,etal.Interleukin-17-dependent autoimmunity to collagen type V in atherosclerosis〔J〕.Circ Res,2010;107(9):1106-16.

6Da Cunha V,Tham DM,Martin-McNuhy B,etal.Enalapfl attenuates angiotensin Ⅱ-induced atherosclerosis and vascular inflammation〔J〕.Atherosclerosis,2005;178(1)：9-17.

7于麗娜,徐延敏,趙輝.氯沙坦對兔動脈粥樣硬化炎癥因子的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2010;18(6):377-8.

8Soraya Taleb,Alain Tedgui,Ziad Mallat.Adaptive T cell immune responses and atherogenesis〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2010;21(2):197-202.

9Korn T,Bet E,Gao W,etal.IL-21 initiates an alternative pathway to in duce proinflammatory T(H) 17 cells〔J〕.Nature,2007;448(7152):484-7.

10Park H,Li Z,Yang XO,etal.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17〔J〕.Nat Immunol,2005;6(6):1133-41.

11Harrington LE,Hatton RD,Mangan PR,etal.Interleukin17-producing CD4 effector T cells develop via a lineage distinct from the T heper type 1 and 2 lineages〔J〕.Nat Immunol,2005;6(11):1123-32.

12Gao Q,Jiang Y,Zhang L,etal.A critical function of Th17 pro-inflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice〔J〕.Immunol,2010;5(10):5820-7.

13Wang Z,Lee J,Zheng Q,etal.Increased Th17 cells in coronary artery disease are associated with neutrophilic inflammation〔J〕.Scand Cardiovasc,2011;45(6):54-61.

14Taleb S,Romain M,Ramkhelawon B,etal.Loss of SOCS3 expression in T cells reveals a regulatory role for interleukin-17 in atherosclerosis〔J〕.Exp Med,2009;206(10):2067-77.

15De Boer OJ,van der Meer JJ,Teeling P,etal.Differential expression of interleukin17 family cytokines in intact and complicated human atherosclerotic laques〔J〕.J Pathol,2010;220(4):499-508.

16Huang F,Kao CY,Wachi S,etal.Requirement for both JAK-mediated PI3K signaling and ACT1/TRAF6/TAK1-dependent NF-kappaB activation by IL-17A in enhancing cytokine expression in human airway epithelial cells 〔J〕.Immunology,2007;179(10):6504-13.

17吉慶偉.高血壓合并頸動脈粥樣硬化患者效應性T細胞活性和血管緊張素Ⅱ水平研究〔D〕.武漢：華中科技大學,2010.

〔2014-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：謝東明(1969-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，主要從事動脈粥樣硬化研究。

基金項目：江西省科技廳項目(No.20133097)

中圖分類號〔〕R544.1〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6030-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.012