肖　婷　羅　健　吳志雄　周松柏　李　芳　楊　軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南　衡陽(yáng)　421001)

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硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化及CX40和CX45表達(dá)的影響

肖婷羅健吳志雄周松柏李芳楊軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南衡陽(yáng)421001)

摘要〔〕目的探討氣體信號(hào)分子硫化氫(H2S)對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌纖維化及縫隙連接蛋白C×40和C×45的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病大鼠組(STZ組)、硫化氫干預(yù)糖尿病大鼠組(STZ+H2S組)及硫化氫干預(yù)正常大鼠組(H2S組)。腹腔注射STZ(40 mg/kg)建立糖尿病模型；糖尿病模型建立后，STZ組與H2S組每天腹腔注射濃度為100 μmol/kg硫氫化鈉溶液(H2S供體)；8 w后處死大鼠。堿水解法檢測(cè)羥脯氨酸表達(dá)水平；Western印跡檢測(cè)CX40和CX45蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，STZ組大鼠心肌組織羥脯氨酸表達(dá)明顯增加(P<0.01)，CX40表達(dá)明顯下降(P<0.001)，而CX45表達(dá)明顯增多(P<0.01)。與STZ組相比，硫化氫干預(yù)后的STZ+H2S組大鼠心肌組織羥脯氨酸明顯下降(P<0.01)，CX40表達(dá)明顯升高(P<0.01)，CX45表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)，但結(jié)果未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論H2S可改善糖尿病大鼠心肌纖維化，同時(shí)上調(diào)CX40蛋白的表達(dá)，可能參與糖尿病大鼠的心肌纖維化和縫隙連接重構(gòu)的調(diào)控。

關(guān)鍵詞〔〕硫化氫；糖尿?。焕w維化； CX40；CX45

第一作者：肖婷(1988-)，女，碩士，主要從事糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制研究。

糖尿病心臟病變包括心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)以及其伴隨的電生理重構(gòu)，一方面心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)最終可導(dǎo)致心力衰竭；另一方面，糖尿病引起的電生理重構(gòu)可明顯增加惡性心律失常和急性心臟事件的發(fā)生率〔1〕。而改善糖尿病心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)及電生理重構(gòu)對(duì)于防治糖尿病心肌病和降低糖尿病患者急性心臟事件的發(fā)生率至關(guān)重要?？p隙連接是心肌細(xì)胞之間的半通道以及直接通訊，其生理作用主要是為心肌細(xì)胞間提供電化學(xué)交流，它與細(xì)胞的代謝和分化，物質(zhì)的運(yùn)輸和電興奮的傳導(dǎo)等有密切關(guān)系?？p隙連接重構(gòu)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞間電傳導(dǎo)異常，從而誘發(fā)心律失常。有研究發(fā)現(xiàn)硫化氫(H2S)可以改善糖尿病大鼠心臟重構(gòu)〔2〕；此外，H2S還可以減少缺血再灌注心律失常的發(fā)生〔3〕，而H2S對(duì)糖尿病心肌縫隙連接重構(gòu)的影響目前尚少見報(bào)道。本研究擬觀察糖尿病大鼠心肌纖維化及心室肌縫隙連接蛋白CX40和CX45表達(dá)的變化，同時(shí)探討H2S對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化和CX40和CX45蛋白表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年的雄性SD大鼠，體重(300±20)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；動(dòng)物飼養(yǎng)在恒溫(23±1℃)、恒濕(60%)的環(huán)境中，白天黑夜各12 h；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以自由獲得食物和水。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals Company;硫氫化鈉購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；羥脯氨酸堿水解法檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于南京建成工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒、購(gòu)于中國(guó)博士德公司細(xì)胞裂解液，購(gòu)于碧云天公司；抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及糖尿病模型建立飼養(yǎng)大鼠1 w；隨機(jī)分為，對(duì)照組、糖尿病大鼠組(STZ組)、硫化氫干預(yù)糖尿病大鼠組(STZ+H2S組)及硫化氫干預(yù)正常大鼠組(H2S組)，每組7只。STZ組與STZ+H2S組大鼠根據(jù)體重腹腔注射STZ(40 mg/kg)；注射后的24 h，為防止大鼠發(fā)生低血糖休克，給予5%葡萄糖水；注射后72 h，尾靜脈采血測(cè)血糖，血糖>16.7 mmol/L提示造模成功。造模成功后，對(duì)照組和STZ組每天腹腔注射等量生理鹽水；STZ+H2S組與H2S組每天腹腔注射硫氫化鈉溶液(100 μmol/kg)；實(shí)驗(yàn)持續(xù)8 w。

1.4堿水解法檢測(cè)羥脯氨酸表達(dá)水平取新鮮大鼠左心室心肌組織，提取組織蛋白，根據(jù)檢測(cè)試劑盒說明書處理樣本，加入96孔板，孵育30 min后置于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(OD值)，根據(jù)OD值計(jì)算羥脯氨酸表達(dá)量。

1.5Western印跡檢測(cè)CX40及CX45蛋白的表達(dá)取新鮮大鼠左心室心肌組織；研磨、離心后提取蛋白；采用BCA比色法進(jìn)行蛋白定量，各組用PBS稀釋至相同濃度；蛋白樣品在100℃煮沸5 min；配置10%SDS-PAGE 分離膠、5%濃縮膠；按每孔20 μl細(xì)胞蛋白樣品上樣，置于電泳緩沖液中電泳，分離目的蛋白，將目的條帶切下，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(10 V，30 min)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用TBST配制的5%BSA封閉2 h，封閉后分別孵育CX40及CX45一抗(稀釋度為1∶500)，4℃過夜；用TBST洗膜3次；每次10 min；用HRP標(biāo)記的二抗(稀釋度為1∶2 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色，曝光后掃描，用Image J圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。GAPDH為內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1H2S對(duì)糖尿病大鼠心室肌羥脯氨酸表達(dá)的影響與對(duì)照組〔(0.327±0.023)μg/mg〕相比，STZ組大鼠左心室心肌組織中羥脯氨酸表達(dá)〔(0.521±0.070)μg/mg〕明顯增加(P<0.01)，而與STZ組相比，STZ+H2S組大鼠心肌組織中的羥脯氨酸水平〔(0.370±0.084)μg/mg〕明顯下降(P<0.01)，H2S組為〔(0.331±0.052)μg/mg〕。

2.2H2S對(duì)糖尿病大鼠心臟CX40蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組(1.000±0.000)相比，STZ組大鼠心肌組織中CX40的表達(dá)(0.646±0.050)明顯下降(P<0.001)，而與STZ組相比，STZ+H2S組大鼠心肌組織中CX40表達(dá)(0.846±0.088)明顯上調(diào)(P<0.01)。H2S組為1.022±0.029。見圖1。

2.3H2S對(duì)糖尿病大鼠心肌CX45蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組(1.000±0.000)相比，STZ組中的大鼠心肌中的CX45表達(dá)(1.219±0.015)明顯增加(P<0.01)，而與STZ組相比，STZ+H2S組大鼠心肌組織CX45表達(dá)(1.195±0.033)有下調(diào)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，H2S組為0.906±0.025，見圖2。

圖1　H2S對(duì)糖尿病大鼠心肌組織CX40表達(dá)的影響

圖2　H2S對(duì)糖尿病大鼠心肌組織CX45表達(dá)的影響

3討論

糖尿病心臟損害是糖尿病主要的并發(fā)癥之一，糖尿病心肌病的主要表現(xiàn)就是心肌的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電生理重構(gòu)，最終可導(dǎo)致心力衰竭和心律失常〔4〕。心肌纖維化是糖尿病心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)，而膠原蛋白是構(gòu)成結(jié)締組織中膠原纖維的主要成分，其中羥脯氨酸的含量最多，故通常以羥脯氨酸可以作為心肌纖維化檢測(cè)指標(biāo)之一。本研究提示糖尿病大鼠心肌發(fā)生纖維化；與此同時(shí)，糖尿病大鼠心臟CX40表達(dá)明顯下降。CX40是電導(dǎo)最快的縫隙連接蛋白，主要分布在心室浦肯野傳導(dǎo)系統(tǒng)〔5〕。已知的縫隙連接蛋白中有5種位于心臟中，包括CX31.9、CX37、CX40、CX43和CX45，在人類心肌主要有CX40、CX43和CX45，其中CX43是心室肌細(xì)胞中主要的縫隙連接蛋白，其對(duì)維持心臟電活動(dòng)的正常進(jìn)行有著重要作用〔6〕，而CX40和CX45在心室肌中相對(duì)較少，研究也相對(duì)較少，但目前認(rèn)為，CX40和CX45在心臟電生理重構(gòu)中也起著重要作用〔7〕。CX45是電導(dǎo)速度慢于CX40的縫隙連接蛋白，其在心室表達(dá)水平略低于心房，主要分布在傳導(dǎo)組織。本文結(jié)果與Yamada等〔8〕在心力衰竭病人左心室肌中觀察到的結(jié)果類似，在其他縫隙連接蛋白，如CX40和CX43表達(dá)下調(diào)得同時(shí)，CX45表達(dá)卻明顯增高，可能是由于CX40和CX43表達(dá)下降后，心肌在電生理重構(gòu)過程中代償性的出現(xiàn)CX45上調(diào)。

H2S是一種具有廣泛生理功能的氣體信號(hào)分子。大量研究證明了H2S的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中扮演著保護(hù)劑的角色〔3，9，10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，氣體信號(hào)分子H2S可明顯逆轉(zhuǎn)糖尿病所致大鼠心臟CX40和CX43表達(dá)下降(CX43的相關(guān)結(jié)果將于另文發(fā)表)，同時(shí)有抑制糖尿病大鼠心肌中CX45表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)，H2S對(duì)正常大鼠心臟組織CX40和CX45的表達(dá)均無(wú)影響。本研究結(jié)果提示，H2S可通過上調(diào)CX40和CX43表達(dá)改善糖尿病大鼠心肌的電生理重構(gòu)，并有抑制糖尿病大鼠心肌中CX45上調(diào)的趨勢(shì)。而H2S干預(yù)改善糖尿病大鼠心肌縫隙連接重構(gòu)的機(jī)制可能與其改善心肌纖維化和心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)有關(guān)。本研究結(jié)果提示H2S可通過減輕糖尿病大鼠心肌纖維化從而改善糖尿病大鼠心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電生理重構(gòu)。但H2S改善縫隙連接重構(gòu)在糖尿病心肌病防治中臨床應(yīng)用以及其保護(hù)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-02-11修回〕

(編輯李相軍)

The effect of hydrogen sulfide on myocardial fibrosis and expressions of CX40 and CX45 in diabetic rats

XIAO Ting, LUO Jian, WU Zhi-Xiong,etal.

Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of South China University，Hengyang 421001，Hunan，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of hydrogen sulfide(H2S) on myocardial fibrosis, CX40 and CX45 expressions of diabetic rats induced by STZ.MethodsSD rats were randomly divided into control, STZ, diabetic mellitus treated with H2S(STZ+H2S), normal rats treated with H2S(H2S)groups. Diabetic model was induced by intraperitoneal injections of STZ with 40 mg/kg body weight. NaHS (H2S donor) was intraperitoneal injected to STZ and H2S group with 100 μmol/kg body weight every day. Rats were killed 8 weeks later. The hydroxyproline expression was tested by Alkail hydrolysis. The CX40 and CX45 expressions were analyzed by Western blot.ResultsThe expression of hydroxyproline was obviously increased in diabetic rats heart, H2S decreased hydroxyproline expression of diabetic rats heart (P<0.01). CX40 expression was obviously decreased in diabetic rats heart, H2S increased CX40 expression of diabetic rats (P<0.01). The expression of CX45 was increased obviously in diabetic rats (P<0.01), H2S decreased expression trend of CX45, however, the difference showed no statistical significance.ConclusionsH2S could improve myocardial fibrosis of diabetic rats and increase expression of CX40. H2S might be related to the regulation of myocardial fibrosis and remodeling of gap junction in diabetic rats.

【Key words】Hydrogen sulfide; Diabetic; Fibrosis; CX40; CX45

通訊作者：楊軍(1972-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病心肌病研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)資助項(xiàng)目(No.81202830)

中圖分類號(hào)〔〕R587〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6025-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.010