張?bào)@宇　張力娜　鄭永慧　初婷婷　葉琳琳　趙　虹　楊子超

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江　哈爾濱　150081)

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體外原代培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的影響

張?bào)@宇張力娜鄭永慧初婷婷葉琳琳趙虹楊子超

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江哈爾濱150081)

摘要〔〕目的建立離體膠質(zhì)瘤組織原代培養(yǎng)細(xì)胞，測(cè)試其對(duì)常用抗癌化療藥物的敏感性。方法手術(shù)切除54例人腦惡性膠質(zhì)瘤，取3級(jí)星形細(xì)胞瘤在培養(yǎng)皿中進(jìn)行原代培養(yǎng)，采用八肽膽囊收縮素(CCK-8)法檢測(cè)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)順鉑(DDP)、長(zhǎng)春新堿(VCR)、替尼泊甙(VM-26)、替莫唑胺(TMZ)、尼莫司汀(ACNU)的體外敏感性。結(jié)果對(duì)原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，敏感率依次為VM-26>TMZ>ACNU>DDP>VCR(P<0.05)。結(jié)論用CCK-8法進(jìn)行化療藥物的敏感性測(cè)定可以更好地輔助臨床化療和放療，避免盲目使用藥物。

關(guān)鍵詞〔〕腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞；八肽膽囊收縮素

第一作者：張?bào)@宇(1979-)，女，博士后，主要從事腦血管病的診斷及治療的研究。

腫瘤干細(xì)胞(CSCs)對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖凋亡和轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)有著重要影響。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲又依賴于其自身運(yùn)動(dòng)和遷徙能力。目前，人急性髓性白血病中已成功分離出腫CSCs〔1〕，而且發(fā)現(xiàn)CSCs對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制以及相應(yīng)的治療具有重要意義。腦膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤〔2～4〕。高級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有強(qiáng)烈的侵襲性〔5〕，表現(xiàn)為急速的細(xì)胞分裂增生，并且伴隨著新生血管生成。本研究通過進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)，探究幾種常見化療藥物在膠質(zhì)瘤綜合治療方法中的效果。

1材料與方法

1.1主要材料及試劑標(biāo)本均取自吉林大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本。5-氟尿嘧啶(上海生工)，胎牛血清(Thermo)，八肽膽囊收縮素(CCK-8)試劑盒(天津百瑩公司)，含5%小牛血清的RPMI培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰蛋白酶、注射用青霉素G鈉、鏈霉素、二甲基亞砜(國(guó)藥試劑)。5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；DYF-880倒置熒光相差顯微鏡(Olympus，日本)；SM600自動(dòng)酶標(biāo)儀(UTRAO)；生物安全柜(BSC-1200A2，香港力康)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Amresco，美國(guó))。

1.2化療藥物尼莫司汀(ACNU)、順鉑(DDP)、長(zhǎng)春新堿(VCR)、替尼泊甙(VM-26)、替莫唑胺(TMZ)。其原液的血漿峰濃度(PPC)分別為0.99、0.53、3.50、5.99、3.67 μg/ml。5種藥物均以此為基點(diǎn)，用生理鹽水稀釋成5種不同濃度，PPC按公式Log(PPC)=-0.788+(0.755×Log LD50)〔6〕。見表1。

1.3方法

1.3.1膠質(zhì)瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化傳代手術(shù)切下無菌腫瘤標(biāo)本，迅速放入冰盒中并送到實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞房中。打開生物安全柜，將新鮮的腫瘤標(biāo)本用含青霉素和鏈霉素、不含血清的培養(yǎng)液進(jìn)行反復(fù)沖洗，直至腫瘤細(xì)胞清洗干凈并且沒有雜質(zhì)。接著將腫瘤細(xì)胞切成小塊組織，移至離心管中混勻離心，加入2 ml提前37°C預(yù)熱好的胰蛋白酶消化2 min，放在37℃培養(yǎng)箱中震蕩1 h，離心機(jī)800 r/min，5 min后吸去上清液，在離心管中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，用吸管吸打、重懸、離心、反復(fù)重懸，用移液槍吸取200 μl重懸的腫瘤細(xì)胞懸液于96孔板中，混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后換液，倒掉原有的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，再加入不含血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，反復(fù)進(jìn)行換液培養(yǎng)孵育，最后置入5%CO2、37℃恒溫、保濕細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用。

1.3.2CCK-8法檢測(cè)取100 μl腫瘤細(xì)胞懸液于96孔板中，并放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(37℃、5%CO2)。每孔中加入10 μl不同濃度的各種抗腫瘤藥物并均設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h，將CCK-8溶液進(jìn)行預(yù)熱，然后向每個(gè)孔中加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h后用酶標(biāo)儀(選擇450 nm波長(zhǎng))檢測(cè)OD值，取3孔OD值的平均數(shù)，根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/無藥組OD值)× 100%，IR在50%以上認(rèn)為對(duì)該藥敏感, IR<50%歸入耐藥。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件行χ2或校正χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1腦膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果54例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，32例培養(yǎng)成功，藥敏實(shí)驗(yàn)價(jià)率為89.3%。24 h時(shí)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，以后梭形細(xì)胞逐漸增多；48 h后腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，梭形較多；72 h后可見星形細(xì)胞明顯突起，呈不規(guī)則及放射狀，細(xì)胞體積增大。見圖1。

圖1　倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)

2.2各種化療藥物對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的IR對(duì)54例惡性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，22例培養(yǎng)失敗。培養(yǎng)成功的32例標(biāo)本中膠質(zhì)瘤Ⅲ級(jí)20例，Ⅳ級(jí)12例(男6例，女6例)。以抗腫瘤藥物在血漿峰濃度(PPC)觀察培養(yǎng)成功的32例標(biāo)本的抑制情況，敏感率從大到小依次為：VM-26(12例，37.5%)>TMZ(11例，34.4%)>ACNU(8例，25.0%)>DDP(7例，21.9%)>VCR(6例，18.8%)(χ2=32.4，P<0.05)。耐藥

率ACNU15例(46.9%)，TMZ18例(56.3%)，DDP10例(31.3%)，VM-26 9例(28.1%)，VCR17例(53.1%)。

3討論

目前，腦膠質(zhì)瘤尤其是惡性腦膠質(zhì)瘤仍然是無法完全治愈的疾病。有研究顯示，腦膠質(zhì)瘤最佳手術(shù)時(shí)間≤15個(gè)月，并且僅26.5%的病人經(jīng)過診斷后能夠生存2年〔6〕。治療以手術(shù)切除為主，并輔以各種化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，以此減輕病人的痛苦。所以，研究化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性變得尤為重要。由于涉及倫理方面的考慮，不能直接以患者個(gè)體為臨床實(shí)驗(yàn)對(duì)象，只能夠利用最接近個(gè)體腫瘤細(xì)胞形狀的原代培養(yǎng)方法，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，模擬出與人腦中生長(zhǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞相近的細(xì)胞進(jìn)行藥敏研究。

原代培養(yǎng)過程中最需要注意的就是污染問題，需嚴(yán)格注意培養(yǎng)時(shí)的無菌操作，任何步驟都應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行；在對(duì)組織進(jìn)行處理時(shí)，需要剔除掉那些壞死的組織，保持組織的相對(duì)純凈，并且取得的組織最好是未經(jīng)放療和化療的，否則會(huì)影響細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功。人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中除膠質(zhì)瘤細(xì)胞外,尚含一定量的腦膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞、腦膜內(nèi)皮細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞〔7〕。將組織切成很小的組織塊，這樣更有利于培養(yǎng)。本文中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)未采用單細(xì)胞培養(yǎng)的方法，導(dǎo)致細(xì)胞之間相互作用，故導(dǎo)致一些細(xì)胞原代培養(yǎng)失敗。

本文采用的5種化療藥物都是如今已用于臨床上的藥物，但由于每個(gè)病人的個(gè)體性質(zhì)不同，所以對(duì)不同病人施用不同種類和濃度的藥物都會(huì)產(chǎn)生差異性。本研究結(jié)果表明惡性腦膠質(zhì)瘤對(duì)VM-26、TMZ相對(duì)敏感，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)存在對(duì)VM-26、TMZ不敏感的個(gè)體。故在惡性腦膠質(zhì)瘤化療前做體外藥敏試驗(yàn)，選擇對(duì)不同個(gè)體敏感的化療藥物進(jìn)行個(gè)體化化療非常必要。

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〔2015-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：楊子超(1950-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦梗死的溶栓治療及溶栓后神經(jīng)功能維護(hù)的研究。

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.p01423)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(No.12531257)；哈爾濱市科技局青年后備人才項(xiàng)目(No.2013RFQYJ062)

中圖分類號(hào)〔〕R73〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6023-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.009