賁　瑩　張鳳華　張　冬　方　倩　杜澍金

(河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合學院，河北　石家莊　050091)

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不同黃芪劑量補陽還五湯對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能及多元醇代謝通絡的影響

賁瑩張鳳華張冬方倩杜澍金

(河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合學院，河北石家莊050091)

摘要〔〕目的探討不同黃芪劑量補陽還五湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)大鼠周圍神經(jīng)功能及多元醇代謝通路的影響。方法采用鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射誘導建立 SD 大鼠DPN模型，并隨機分為模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組和甲鈷胺組，每組10只。黃芪60 g組和黃芪120 g組分別用含對應量黃芪的補陽還五湯濃煎劑灌胃，甲鈷胺組用175 μg·kg-1·d-1甲鈷胺灌胃。另設正常組10只。給藥12 w后，檢測空腹血糖(FBG)、坐骨神經(jīng)傳導速度，醛糖還原酶(AR)和Na+-K+-ATP酶活性及山梨醇、肌醇、果糖等多元醇含量。結(jié)果與模型組比較，黃芪120 g組和甲鈷胺組MCV明顯提高(P<0.05)；黃芪60 g組、黃芪120 g組和甲鈷胺組SCV、肌醇含量顯著提高(P<0.05)，其中黃芪120 g組增高更明顯(P<0.01)；AR活性、果糖含量明顯下降(P<0.05)，黃芪120 g組降低更顯著(P<0.01)。黃芪120 g組山梨醇含量較模型組顯著下降(P<0.01)，Na+-K+-ATP酶活性顯著升高(P<0.05)。黃芪120 g組山梨醇及果糖含量較黃芪60 g組下降(P<0.05)。結(jié)論補陽還五湯能有效抑制 DPN 大鼠的多元醇代謝通路，發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，以120 g黃芪劑量補陽還五湯的抗氧化作用為佳。

關鍵詞〔〕糖尿病周圍神經(jīng)病變；多元醇代謝通路；補陽還五湯；黃芪

第一作者：賁瑩(1979-)，女，講師，碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)病學研究。

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是常見的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率較高，其發(fā)病機制尚未完全闡明，但大量研究表明多元醇通路的激活是引發(fā)DPN的重要因素之一。中醫(yī)認為本病主要為絡氣虛滯，淤血阻絡，臨床治法上應用補氣活血通絡的補陽還五湯加減治療取得了較好的療效。但對其能否通過抑制多元醇通路代謝而減少周圍神經(jīng)損傷，還缺少客觀實驗證據(jù)。本研究探討補陽還五湯對DPN大鼠周圍神經(jīng)功能和多元醇代謝通絡的影響，并觀察不同黃芪劑量補陽還五湯的療效，以期明確補陽還五湯方發(fā)揮治療作用的途徑、效果及方中黃芪的最佳劑量。

1材料與方法

1.1動物試劑與藥物雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g(2月齡左右)，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(冀)2003-1-003。鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司；補陽還五湯原方來源《醫(yī)林改錯》，黃芪120 g，當歸6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，簡稱黃芪120 g組。另設黃芪60 g，其余藥物劑量不變，簡稱為黃芪60 g組。以上兩組藥物分別加水浸泡2 h，水煎2次，每次40 min，先后兩次藥液合并、濃縮，分別制成含生藥2.4、1.36 g/ml的藥液。甲鈷胺(彌可保)，日本衛(wèi)材株式會社，批號：0006715；Na+，K+-ATP酶活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2儀器One touch Ⅱ型血糖儀(美強生公司)；DANTEC Cantata肌電圖誘發(fā)電位儀；MPF-4型熒光分光光度計(日本日立公司)；GC6890氣相色譜分析儀(美國安捷倫公司)。

1.3方法

1.3.1分組、建立動物模型50只SD大鼠按體重相似隨機分為5組，正常組、模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、甲鈷胺組，每組10只。在禁食12 h后模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、甲鈷胺組大鼠給予一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后大鼠禁食8 h測鼠尾靜脈血測血糖≥16.7 mmol/L確立為糖尿病大鼠模型，正常組大鼠注射等量的檸檬酸緩沖液。

1.3.2給藥給藥造模成功立即開始灌胃，黃芪60 g組、黃芪120 g組按10 ml·kg-1·d-1分別用相應黃芪量藥液灌胃；甲鈷胺組按175 μg·kg-1·d-1甲鈷胺灌胃；正常組和模型組給予等體積的蒸餾水。實驗期間自由飲食，連續(xù)給藥12 w。

1.4觀察指標

1.4.1坐骨神經(jīng)傳導速度測定給藥結(jié)束后，水合氯醛麻醉大鼠，用肌電圖儀檢測大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)傳導速度。第一刺激部位在坐骨窩，第二刺激部位在踝部。均用2個針電極經(jīng)皮插入，電極間距在2 mm，接地于尾部，保持皮溫 30℃。①運動神經(jīng)性傳導速度(MCV)：用方形波(10～20 mA，40 μs脈波寬) 刺激神經(jīng)，用2個針電極在同側(cè)的足部骨間肌記錄復合肌肉動作電位。記錄3對不同M波的潛伏期，取平均值，兩個刺激部位間的傳導時間為近端和遠端潛伏期差，用彎角規(guī)測量兩個刺激部位間的距離。MCV(m/s)=距離/潛伏期差值。②感覺神經(jīng)傳導速度(SCV)：用方形波(10～20 mA，40 μs脈波寬)記錄6對在坐骨窩和踝激發(fā)的H反射潛伏期，用彎角規(guī)測量兩個刺激部位間的距離。SCV(m/s)=距離/潛伏期差值。

1.4.2醛糖還原酶(AR)活性測定實驗12 w后取大鼠坐骨神經(jīng)，冷生理鹽水沖洗、稱重后，加入1.5 ml的冷生理鹽水勻漿，離心，所得上清為坐骨神經(jīng)勻漿液。考馬斯亮藍法測定勻漿液的蛋白含量。參照文獻的方法檢測坐骨神經(jīng) AR 活性〔1〕。

1.4.3多元醇含量的測定取坐骨神經(jīng)勻漿液0.4 ml，加入10%三氯醋酸0.1 ml，振蕩10 s，靜置2 min，離心15 min，取上清液0.3 ml，減壓蒸干。加鹽酸羥胺10 mg，吡啶0.5 ml，90℃加熱15 min，不斷振蕩。取出冷卻至室溫。加入醋酐0.5 ml，90℃水浴反應20 min，取出，90℃水浴減壓濃縮至干。加入0.5 ml氯仿，溶解，采用毛細管柱氣相色譜法分離測定樣品中山梨醇、肌醇、果糖含量，并折算為勻漿中每1 mg蛋白中所含測定物的量。測定樣本中各加入0.25 mg 6，7-二甲氧基香豆素作為內(nèi)標。色譜條件：毛細管柱：HP-5(0.32 mm×30 m)；載氣：氮氣；流速：0.5 ml/min；初始溫度：160℃；最高溫度：320℃；檢測器：氫火焰檢測器；進樣量：0.4 μl。

1.4.4Na+-K+-ATP酶活性測定采用購自南京建成生物工程研究所的Na+-K+-ATP酶活性測定試劑盒，嚴格依照說明進行操作，測定并計算坐骨神經(jīng)勻漿液中的Na+-K+-ATP酶活性。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS11.0軟件，行方差分析和SNK法兩兩比較。

2結(jié)果

2.1FBG變化模型組、黃芪120 g組、黃芪60 g組、甲鈷胺組FBG顯著高于正常組(P<0.05)。黃芪120 g組FBG略低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組坐骨神經(jīng)傳導速度的比較與正常組比較，模型組坐骨神經(jīng)MCV和SCV明顯減慢(P<0.01)；與模型組比較，黃芪120 g組和甲鈷胺組MCV明顯提高(P<0.05)；黃芪60 g組、黃芪120 g組和甲鈷胺組SCV顯著提高，其中黃芪120 g組SCV增高更明顯(P<0.01)；三藥物干預組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組坐骨神經(jīng)AR活性比較模型組比正常組AR活性均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，黃芪60 g組、黃芪120 g組及甲鈷胺組AR活性降低(P<0.05，P<0.01)，三藥物干預組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4各組坐骨神經(jīng)多元醇含量比較模型組比正常組山梨醇、果糖含量顯著升高，肌醇含量顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，黃芪120 g組山梨醇含量顯著下降(P<0.01)，黃芪60 g組、黃芪120 g組及甲鈷胺組肌醇含量升高，果糖含量降低(P<0.05，P<0.01)，黃芪120 g組山梨醇及果糖含量較黃芪60 g組下降(P<0.05)。見表2。

2.5各組坐骨神經(jīng)Na+-K+-ATP酶活性比較模型組比正常組Na+-K+-ATP酶活性顯著降低。黃芪120 g組Na+-K+-ATP酶活性較模型組顯著升高(P<0.05)。三藥物干預組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

組別FBG(mmol/L)4w8w12wMCV(m/s)SCV(m/s)正常組4.96±0.631)5.02±0.581)4.87±0.511)45.26±4.351)46.45±7.121)模型組26.54±3.7725.83±4.1426.10±3.8130.17±5.1629.21±9.38黃芪60g組27.21±3.2626.36±3.5225.97±2.7234.82±6.3637.06±6.742)黃芪120g組26.25±3.8925.74±3.1624.16±3.0537.36±6.222)40.17±5.251)甲鈷胺組27.12±4.7627.03±3.8526.68±3.7236.30±7.122)38.14±6.862)

與模型組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

組別AR活性(U/mgprot)多元醇含量(μg/mgprot)山梨醇肌醇果糖Na+-K+-ATP酶活性(μmolPi·mg-1·h-1)正常組11.21±3.851)126.59±27.331)24.17±5.681)112.58±24.751)0.79±0.081)模型組17.86±4.54219.43±42.8016.36±3.20197.84±41.110.27±0.21黃芪60g組13.73±4.472)192.25±44.0119.28±4.342)160.73±34.972)0.41±0.27黃芪120g組12.23±4.061)154.56±33.981)3)20.65±3.041)128.36±32.811)3)0.62±0.412)甲鈷胺組13.42±3.832)184.35±45.2719.74±3.352)156.75±39.182)0.46±0.38

與模型組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與黃芪60 g組比較：3)P<0.05

3討論

DPN是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機制目前尚未完全明了，一般認為與多元醇通路、己糖胺途徑、蛋白激酶C途徑的激活和糖基化終產(chǎn)物的形成、微血管病變、氧化應激反應等諸多因素有關〔2，3〕。多元醇通路代謝增強是引發(fā)糖尿病周圍神經(jīng)病變的重要因素。AR是此途徑中的第一個酶，亦被認為是引發(fā)糖尿病周圍神經(jīng)病的關鍵因素〔4〕。組織中葡萄糖大量增加時，AR被激活，葡萄糖被大量轉(zhuǎn)化為山梨醇，后者還可進一步轉(zhuǎn)化為果糖。山梨醇及果糖等多元醇含量增多導致胞內(nèi)產(chǎn)生高滲狀態(tài)；為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，其他滲透物將會減少，如肌醇(在信號轉(zhuǎn)導中起重要作用)、?；撬?重要的抗氧化劑)等〔5〕。而肌醇的減少又影響蛋白激酶C和鈣調(diào)節(jié)蛋白的活性，導致Na+-K+-ATP酶活性下降，細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性受損，進而引起周圍神經(jīng)髓鞘分離、脫失，軸索變性以及神經(jīng)傳導速度減慢等改變〔6〕。

本實驗結(jié)果顯示，補陽還五湯可使DPN大鼠神經(jīng)傳導速度增高，降低體內(nèi)AR活性使山梨醇、果糖含量下降，肌醇含量升高，從而增強Na+-K+-ATP酶活性。此結(jié)果提示補陽還五湯能有效減低DPN大鼠多元醇通路代謝，發(fā)揮其保護作用。

補陽還五湯為清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)，配伍用量特點為君藥黃芪劑量是其他活血通絡藥總和的5倍，《醫(yī)林改錯》中寫到 “黃芪用一二兩，以后漸加至四兩”，重用黃芪旨在令氣旺血行而瘀去絡通。本結(jié)果中黃芪120 g組山梨醇、果糖含量顯著低于60 g組，說明隨著黃芪劑量的增大，補陽還五湯的神經(jīng)保護作用愈發(fā)顯著，臨床治療時推薦按王清任原方120 g黃芪用量使用。

參考文獻4

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〔2014-10-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：河北省教育廳科學技術研究青年基金項目(QN2014019)

中圖分類號〔〕R285.5〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7040-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.032