張　岳　唐年亞

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,河南　南陽(yáng)　473000)

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變應(yīng)性鼻炎SD大鼠模型制備

張?jiān)捞颇陙?/p>

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,河南南陽(yáng)473000)

摘要〔〕目的探討SD大鼠變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型的最佳制備方法。方法選取SD大鼠60只，隨機(jī)分為空白Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ組，模型Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ組，每組各10只。采用卵清蛋白(OVA)和熱滅活百日咳桿菌為致敏原，腹腔注射基礎(chǔ)致敏，滴鼻或霧化吸入激發(fā)，制備SD大鼠AR動(dòng)物模型。空白各組以生理鹽水代替OVA。結(jié)果所有模型組大鼠癥狀總評(píng)分均>5分，并具備典型的AR的病理表現(xiàn)，提示造模成功。模型組Ⅲ組SD大鼠行為學(xué)變化、血清IgE水平、鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)和鼻黏膜細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1表達(dá)較模型組Ⅰ和Ⅱ組更為理想(P<0.05)。結(jié)論長(zhǎng)期、持續(xù)抗原攻擊引起的鼻黏膜變應(yīng)性炎癥程度較短期效果好，癥狀典型，速發(fā)相反應(yīng)和遲發(fā)相反應(yīng)明顯，血清IgE水平、鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)和鼻黏膜ICAM-1表達(dá)理想，鼻黏膜病理學(xué)變化顯著，更利于AR動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。

關(guān)鍵詞〔〕變應(yīng)性鼻炎；SD大鼠；模型

第一作者：張?jiān)?1978-)，女，碩士，講師，主要從事五官科學(xué)研究。

變應(yīng)性鼻炎(AR)指發(fā)生在鼻黏膜的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，由于鼻黏膜存在組織重塑，導(dǎo)致AR治療緩慢且難度較大〔1〕。臨床主要表現(xiàn)為陣發(fā)性噴嚏，大量清水樣鼻涕，鼻塞、鼻癢和嗅覺(jué)減退，并可引起多種并發(fā)癥如哮喘、鼻竇炎、鼻息肉、分泌性中耳炎等，給患者的生活和工作帶來(lái)痛苦，且加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此AR的研究和探討對(duì)哮喘、鼻竇炎、鼻息肉等防治意義重大。解決變應(yīng)性鼻炎治療方法的根本途徑是加強(qiáng)其生理病理的研究，而探討其動(dòng)物模型的方法則是進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用不同造模方法制備SD大鼠AR動(dòng)物模型。

1材料與方法

1.1致敏原及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用卵清蛋白(OVA)和熱滅活百日咳桿菌為致敏原，配以Al(OH)3為佐劑。由于大鼠與人同源性較好，且抗體豐富，便于豐富實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線，故筆者選取SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2方法

1.2.1造模方法選取SD大鼠60只(體重200～300 g)，雌雄各半，隨機(jī)分為空白Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ組，模型Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ組，每組10只。空白各組以生理鹽水代替OVA，余方法同造模組。模型Ⅰ組于第4天使用50 μg OVA和5 mg Al(OH)3腹腔注射進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，分別于第14、16天使用50 μg OVA滴鼻進(jìn)行激發(fā)；模型Ⅱ組于第0、7天使用10 μg OVA和2 mg Al(OH)3腹腔注射進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，分別于第14、16天使用1% OVA霧化吸入進(jìn)行激發(fā)；模型Ⅲ組于第1～15天，隔日一次，使用20 μg OVA、1 mgAl(OH)3和1×109百日咳桿菌腹腔注射進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，于第16～26天使用10 μg OVA滴鼻進(jìn)行激發(fā)。

1.2.2模型成功判定最后一次OVA激發(fā)后15 min內(nèi)，記錄動(dòng)物搔鼻、噴嚏、鼻溢液等癥狀，根據(jù)造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)判定造模結(jié)果〔2〕。鼻癢：搔鼻≤2次 1分，劇烈搔鼻不止3分，介于二者之間評(píng)2分。噴嚏：1～2個(gè)/次 1分，3～10個(gè)/次 2分，超過(guò)11個(gè)/次 3分。鼻溢液：流至前鼻孔1分，超出前鼻孔2分，涕流滿面3分。以上各項(xiàng)指標(biāo)均采用疊加量化記分法，總分>5分表示模型成功。

1.2.3動(dòng)物處死及組織取材全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予10%水合氯醛腹腔麻醉摘眼球法取血，離心并獲得血清?？瞻准澳Ｐ廷?Ⅱ組第18天處死動(dòng)物，空白及模型Ⅲ組于第26天處死動(dòng)物，刮取鼻黏膜，放入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)處理后，光鏡檢查鼻黏膜組織病理學(xué)變化。

1.2.4觀察指標(biāo)癥狀觀察：觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物搔鼻動(dòng)作、噴嚏、鼻溢液及覓食行為，記錄癥狀總評(píng)分。檢測(cè)SD大鼠血清中IgE水平。觀察高倍鏡(×400)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù)，選擇數(shù)5個(gè)視野，記錄均值。觀察高倍鏡(×400)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼻黏膜中細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1表達(dá)。觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼻黏膜病理學(xué)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

根據(jù)造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，所有模型組大鼠癥狀總評(píng)分均>5分，并具備典型的AR的病理表現(xiàn)，提示造模成功，且以模型Ⅲ組最為理想。癥狀總評(píng)分、血清IgE水平、鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)、鼻黏膜ICAM-1表達(dá)等指標(biāo)，空白組Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但模型組Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ組與對(duì)應(yīng)的空白組比較有顯著差異(P<0.01)。血清IgE水平模型Ⅰ/Ⅲ與Ⅱ組比較差異顯著(P<0.05)，模型Ⅰ與Ⅲ組比較，差異顯著(P<0.05)。鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)和ICAM-1表達(dá)：模型組Ⅰ/Ⅱ與Ⅲ組比較差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)表1。空白組大鼠鼻黏膜病理可見(jiàn)上皮部分完整，黏膜層結(jié)構(gòu)正常，可見(jiàn)正常疏松結(jié)締組織和血管，未見(jiàn)或僅見(jiàn)個(gè)別EOS細(xì)胞。模型組大鼠鼻黏膜病理可見(jiàn)上皮下血管擴(kuò)張充血、水腫、黏膜壞死脫落，間質(zhì)中可見(jiàn)大量EOS及其他炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

組別癥狀總評(píng)分血清IgE水平(ng/ml)鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)(個(gè)/HP)鼻黏膜ICAM-1表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞面積百分比)空白Ⅰ組0.35±0.0618.65±2.0060.52±0.1721.03±0.281空白Ⅱ組0.41±0.1220.13±1.9870.55±0.1131.24±0.343空白Ⅲ組0.38±0.1119.64±2.6410.48±0.0891.08±0.194模型Ⅰ組5.86±0.641)40.18±3.6511)2)3)18.67±1.5831)2)3)15.33±4.6571)2)3)模型Ⅱ組6.38±1.571)53.42±5.1721)3)19.88±3.4971)3)17.65±2.6181)3)模型Ⅲ組7.67±1.321)48.08±4.3511)2)26.36±4.3911)2)23.52±3.4261)2)

與對(duì)應(yīng)空白組比較：1)P<0.01；與模型Ⅱ組比較：2)P<0.05；與模型Ⅲ組比較：3)P<0.05

圖1　空白及模型組鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)及ICAM-1表達(dá)(HE，×400)

3討論

本研究各造模方法比較：Ⅰ/Ⅱ組基礎(chǔ)致敏和激發(fā)試劑相同，Ⅲ組在其基礎(chǔ)上增加百日咳桿菌；試劑使用量Ⅰ組最大，Ⅲ組次之，Ⅱ組最??；Ⅰ/Ⅲ組滴鼻法激發(fā)方法，Ⅱ組霧化吸入法激發(fā)；造模時(shí)間上Ⅲ組用時(shí)最長(zhǎng)。

AR大鼠行為學(xué)變化是評(píng)價(jià)不同造模方法的重要指征，由于鼻黏膜生理的特殊性，當(dāng)OVA溶液刺激鼻黏膜時(shí)，可產(chǎn)生噴嚏，同時(shí)釋放神經(jīng)肽類物質(zhì)，導(dǎo)致鼻黏膜血管擴(kuò)張，通透性增加等〔3〕，產(chǎn)生鼻癢搔鼻動(dòng)作。本研究通過(guò)觀察SD大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢液等指標(biāo)的，旨在判定AR動(dòng)物模型的造模效果。Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ組行為學(xué)變化以模型組Ⅲ組癥狀總評(píng)分最高，行為學(xué)變化最為明顯。

AR是特異性個(gè)體接觸過(guò)敏原后，鼻黏膜出現(xiàn)的I型變態(tài)反應(yīng)性疾病。先由IgE介導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，出現(xiàn)炎性介質(zhì)釋放的速發(fā)相反應(yīng)，產(chǎn)生早期典型癥狀如陣發(fā)性噴嚏，大量清水樣鼻涕，鼻塞、鼻癢〔4〕；繼之鼻黏膜出現(xiàn)以EOS為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的遲發(fā)相反應(yīng)。血清IgE水平比較：模型Ⅱ組最高，模型Ⅲ組次之。由于模型Ⅱ組采用霧化吸入進(jìn)行激發(fā)，雖能夠使鼻黏膜充分接觸變應(yīng)原，但1% OVA持續(xù)霧化吸入易導(dǎo)致下呼吸道累計(jì)，從而引發(fā)哮喘〔5〕，影響指標(biāo)的測(cè)定。由于發(fā)生AR時(shí)，鼻黏膜是免疫反應(yīng)靶組織，EOS是變態(tài)反應(yīng)主要效應(yīng)細(xì)胞，EOS由介質(zhì)激活移向炎癥區(qū)并釋放活性物質(zhì)引起局部組織損傷、炎癥擴(kuò)散，所以EOS浸潤(rùn)及數(shù)量的增加是AR的重要特征。ICAM-1可引起血管擴(kuò)張和血流減慢，并可穿出血管壁引起炎性細(xì)胞聚集，加重炎癥反應(yīng)。AR發(fā)病過(guò)程中，炎癥細(xì)胞尤其是EOS聚集和激活，ICAM-1起著重要的作用，ICAM-1增高也是判斷AR模型質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

動(dòng)物模型是研究人類疾病的重要工具，建立一種既能反映AR典型癥狀，又能反映其相應(yīng)病理生理改變的動(dòng)物模型，十分必要且實(shí)用。理想的動(dòng)物疾病模型要求能全面、準(zhǔn)確地反映疾病各項(xiàng)特征，且具有良好的可操作性與可重復(fù)性。OVA致AR造模法相對(duì)成熟，采用廣泛，技術(shù)簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、造模時(shí)間短，因此可以通過(guò)建立SD大鼠AR動(dòng)物模型，探索AR的發(fā)生機(jī)制、發(fā)展規(guī)律和治療對(duì)策。本研究表明，雖然各造模法均可制備出AR動(dòng)物模型，但長(zhǎng)期、持續(xù)抗原攻擊引起的鼻黏膜變應(yīng)性炎癥程度較短期效果好，癥狀典型，速發(fā)相反應(yīng)和遲發(fā)相反應(yīng)明顯，血清IgE水平、鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)和鼻黏膜ICAM-1表達(dá)理想，鼻黏膜病理學(xué)變化顯著，更利于AR動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。

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〔2014-09-16修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：南陽(yáng)市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012GG045)

中圖分類號(hào)〔〕R76〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-6992-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.011