周秀華　方麗卉

(中國醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院重癥醫(yī)療科，遼寧　沈陽　110032)

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Toll樣受體-9在細(xì)菌DNA誘導(dǎo)小鼠心肌炎癥反應(yīng)中的作用

周秀華方麗卉

(中國醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院重癥醫(yī)療科，遼寧沈陽110032)

摘要〔〕目的探討Toll樣受體-9(TLR-9)及其致病性配體(即細(xì)菌DNA)在膿毒癥小鼠心肌炎癥反應(yīng)中心功能不全的作用。方法使用人工合成的細(xì)菌DNA(CpG-ODN)，分別作用于TLR-9組 及TLR-9缺陷(TLR9-D)的小鼠，測定6 h時(shí)間點(diǎn)炎癥標(biāo)志物：腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β及IL-6、血清腦鈉肽(BNP)水平及心動(dòng)超聲的心功能結(jié)果。結(jié)果在野生型小鼠，CpG-ODN導(dǎo)致心臟發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為TNF-α、IL-1β，IL-6及BNP的水平升高及心動(dòng)超聲示心臟收縮機(jī)舒張功能明顯降低(P<0.05)；而在TLR9-D小鼠這種炎癥反應(yīng)卻沒有出現(xiàn)。結(jié)論細(xì)菌DNA通過TLR-9的介導(dǎo)，導(dǎo)致心肌炎性反應(yīng)及細(xì)胞因子的生產(chǎn)并且產(chǎn)生心功能不全,TLR-9與心功能不全呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕膿毒癥；TLR-9；感染；炎癥；心肌細(xì)胞；心功能不全；腦鈉肽

第一作者：周秀華(1965-)，女，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病重癥研究。

心血管功能障礙是膿毒癥的嚴(yán)重并發(fā)癥，膿毒癥患者并發(fā)心血管功能障礙的概率逐漸上升可達(dá)40%〔1〕，并使死亡率增加20%～70%〔2〕。在膿毒癥的相關(guān)試驗(yàn)中，血液中可檢測到較高水平的腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β〔3〕等細(xì)胞因子。目前，對(duì)心肌中Toll樣受體(TLR)-9的作用仍知之甚少，但是在鼠心臟中已檢測到其基本表達(dá)。有研究提示，TLR-9作為CpG DNA的受體分子在膿毒癥心肌損傷過程中可能扮演著關(guān)鍵角色〔3〕。本研究探討TLR-9在細(xì)菌DNA誘導(dǎo)心肌炎癥反應(yīng)中腦鈉肽(BNP)的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中國醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供C57BL/6基因背景的小鼠即TLR-9正常型(野生型)，TLR-9缺陷(TLR09-D)小鼠(日本滋賀大學(xué)提供)參加實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠及TLR9-D小鼠均為6～8周齡，雌雄各半，體重(18±2)g。野生型小鼠(TLR-9組)20只，TLR-9缺陷(TLR9-D組)小鼠20只。

1.2CpG-ODN腹腔內(nèi)注射兩組小鼠腹腔內(nèi)注射1 mg/kg的D-半乳糖胺致敏，30 min后，再次注射1 nmol/g的CpG-ODN(ODN 1668 FITC;深圳欣博盛生物科技有限公司)。CpG-ODN為人工合成，不含內(nèi)毒素，溶解于無內(nèi)毒素的水中后使用。

1.3兩組超聲心動(dòng)圖及心功能的比較THONOS2500心臟彩色超聲診斷儀(美國惠普公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，6 h時(shí)用NOS2500心臟彩色超聲診斷儀及7.5 MHz相控陣探頭無創(chuàng)檢測小鼠心功能評(píng)價(jià)心功能：左室收縮末期內(nèi)徑(LVEDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、室間隔厚度(IVST)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室縮短率(LVFS)。

1.4血TNF-α，IL-1β、IL-6及BNP檢測6 h從腹主動(dòng)脈穿刺獲得血液樣本。3 000 r/min離心血液10 min，并將上層清液(血漿)，測定TNF-α，IL-1β、IL-6和BNP，使用ELISA法(美國BIO-TEX全自動(dòng)酶標(biāo)儀，ELISA檢測試劑盒上海藍(lán)基生物技術(shù)有限公司)

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1臨床表現(xiàn)腹腔內(nèi)先后注射D-半乳糖胺及CpG-ODN后，TLR9正常組(野生小鼠組)出現(xiàn)膿毒癥樣癥狀，如精神萎靡、腹瀉、口吐泡沫機(jī)氣喘等；而缺陷小鼠TLR9-D仍保持實(shí)驗(yàn)前狀態(tài)，沒有出現(xiàn)類似的炎癥反應(yīng)征象。

2.2兩組心肌超聲心動(dòng)圖、心功能及炎癥因子水平比較見表1，表2。

指標(biāo)TLR-9-D組TLR-9正常組LVEDs(mm)2.26±0.184.83±0.531)LVEDd(mm)4.98±0.297.82±0.621)IVST(mm)0.98±0.091.35±0.151)LVEF(%)78.23±0.7960.50±2.521)LVFS(%)44.76±0.8231.82±2.021)

與TLR-9-D組比較：1)P<0.05，下表同

組別TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)BNP(pmol/L)TLR-9-D組39.44±5.5412.85±1.3941.01±4.28209.3±55.23TLR-9正常組50.23±7.661)27.0±5.9541)49.63±1.871)1203±136.211)

3討論

隨著膿毒癥的增加，膿毒癥所致的心肌損傷是非冠心病ICU中致死的首要原因；目前針對(duì)其發(fā)生發(fā)展機(jī)制已提出了幾種假說：①細(xì)菌細(xì)胞壁成分LPS的增多〔3〕；②各種細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生增多〔4〕；③活性氧/氮等物質(zhì)增多〔4〕。有研究提出，在體內(nèi)模型中，TLR4和CD14的缺陷可消除LPS誘導(dǎo)的心肌收縮功能障礙。類似的試驗(yàn)也提出，金黃色葡萄球菌通過TLR2的介導(dǎo)使心肌發(fā)生功能障礙。這提示TLR系統(tǒng)可能在此過程中發(fā)揮重要作用。激活高等動(dòng)物天然免疫應(yīng)答的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)廣泛存在于病原體細(xì)胞表面，PAMPs的識(shí)別是Toll樣受體(TLRs)家族介導(dǎo)的。細(xì)菌 DNA基因組中的未甲基化CpG模體的出現(xiàn)頻率比在高等動(dòng)物中高得多，高等動(dòng)物免疫系統(tǒng)通過TLR-9來察覺病原體中的未甲基化CpG 模體，而不識(shí)別自身的DNA。TLR-9是TLR 家族的Ⅰ型膜蛋白，在B細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)等免疫細(xì)胞中表達(dá)，TLR-9對(duì)CpG DNA的識(shí)別作用是CpG結(jié)構(gòu)特異性的，TLR-9可介導(dǎo)CpG激活DC、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，并誘導(dǎo)細(xì)胞分泌炎癥因子和Th1型細(xì)胞因子，從而激活天然和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

細(xì)菌DNA(CpG-ODN)可能通過TLR-9啟動(dòng)先天應(yīng)答，導(dǎo)致膿毒癥休克。TLR-9定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并在CpG的刺激下招募到內(nèi)體小泡〔5〕。此后，TLR9與CpG-ODN共定位導(dǎo)致細(xì)胞的活化。針對(duì)配體結(jié)合的研究表明，細(xì)菌DNA直接與TLR-9結(jié)合，再與銜接分子MyD88相作用，導(dǎo)致IL-1受體相關(guān)激酶家族和絲裂原活化蛋白激酶的激活。

本實(shí)驗(yàn)TLR-9缺陷的動(dòng)物TNF-α，IL-1β及BNP水平明顯低于TLR-9正常組，對(duì)于超生心動(dòng)圖所示的心衰指標(biāo)(LVEDs、LVEDd、IVST、LVEF及LVFS)兩組也存在明顯差異。而BNP作為心衰的標(biāo)志物已得到共識(shí)〔6〕。

TLR-9缺陷動(dòng)物細(xì)胞對(duì)CpG-ODN的攝取比較緩慢。而在野生型小鼠(TLR-9正常組)，CpG-ODN所引起的TLR-9 mRNA和蛋白質(zhì)的上調(diào)具卻有顯著的時(shí)間依賴性。

在野生型小鼠，CpG-ODN導(dǎo)致血液TNF-α，IL-1β、IL-6和BNP水平的表達(dá)的顯著增加。此外，TNF-α，IL-1β和IL-6的血漿水平增加表明在野生型動(dòng)物出現(xiàn)了全身性炎癥反應(yīng)。BNP水平升高說明炎癥反應(yīng)較重，故導(dǎo)致心肌損害較重；相比之下，在TLR-9缺陷小鼠CpG-ODN刺激后上述細(xì)胞因子的水平?jīng)]有較大變化。

目前研究表明，在體內(nèi)，心肌的某些炎癥反應(yīng)是TLR-9依賴性的，而這種反應(yīng)在TLR-9缺陷動(dòng)物是不存在的。

綜上，細(xì)菌DNA在TLR-9的介導(dǎo)下，可導(dǎo)致心肌的炎癥反應(yīng)及功能障礙。TLR-9在細(xì)菌DNA配體CPG-ODN的作用下，通過大量產(chǎn)生TNF-α，IL-1β和IL-6，造成心肌細(xì)胞炎癥損傷，所以炎癥反應(yīng)激烈的小鼠心衰出現(xiàn)的較早及較重。而TLR-9的缺失將阻斷這一進(jìn)程。膿毒癥動(dòng)物心肌損傷過程中，TLR-9扮演關(guān)鍵角色。

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〔2014-12-29修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2011022562011)

中圖分類號(hào)〔〕R631〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-6987-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.009