楊　瓊　戴桃李　潘　婭　陳　粲

(貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院藥學(xué)教研室，貴州　貴陽　550025)

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針刺耳穴對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

楊瓊戴桃李1潘婭2陳粲2

(貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院藥學(xué)教研室，貴州貴陽550025)

摘要〔〕目的探討針刺耳穴治療血管性癡呆(VD)大鼠的機(jī)制。方法四血管阻斷法建立VD大鼠模型，造模后針刺“腎”、“心”耳穴治療，用Morris水迷宮檢測大鼠空間記憶能力，免疫組織化學(xué)法檢測其海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞表達(dá)。結(jié)果針刺耳穴后，VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高(P<0.01，P<0.05)，海馬ChAT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元明顯增多(P<0.05)。結(jié)論針刺“腎”、“心”耳穴可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，可能與其促進(jìn)ChAT在腦的表達(dá)、保護(hù)膽堿能神經(jīng)元有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕血管性癡呆(VD)；針刺；耳穴；學(xué)習(xí)記憶；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶

1暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心

2貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

第一作者：楊瓊(1980-)，女，碩士，講師，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。

血管性癡呆(VD)是由于缺血或出血性腦血管病及全腦缺血、缺氧引起的認(rèn)知障礙，以學(xué)習(xí)記憶功能缺損為主，可伴有語言、運(yùn)動(dòng)、視空間技能及人格障礙等表現(xiàn)〔1〕。在我國，VD是老年期癡呆中最常見的類型之一，也是目前可預(yù)防和有希望治療的一種癡呆，但目前尚缺乏特效的VD治療方法〔2〕。中醫(yī)療法具有操作簡單、無毒副作用、標(biāo)本兼治的優(yōu)勢〔3,4〕。本研究在制備VD大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用針刺“心”、“腎”耳穴的方法進(jìn)行治療，然后檢測VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并測定海馬齒狀回處膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的水平，以探討此方法的有效性及其可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑5～6月齡健康雄性SD大鼠45只，體重280～300 g，清潔級，由貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。ChAT檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備和治療方法大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和針刺組，每組15只。采用改良Pulsinelli四血管阻斷(4-VO) 法建立VD大鼠模型。模型組和針刺組麻醉后行背側(cè)頸正中切口，用電凝針燒灼雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞；再行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，24 h后用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，5 min×3次，每次間隔1 h。對照組處理步驟同上，但不進(jìn)行椎動(dòng)脈燒灼和頸總動(dòng)脈夾閉。針刺組在造模后，參照圖譜定位，自制耳針刺激于“腎”、“心”耳穴，持續(xù)4 w。

1.2.2 行為學(xué)測試實(shí)驗(yàn)第4周進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。迷宮分為4個(gè)象限，在第Ⅲ象限置一個(gè)站臺，沒于水下2 cm。第1～6天行定向航行試驗(yàn)：將大鼠按Ⅰ～Ⅳ的順序依次放入水中，記錄大鼠60 s內(nèi)從入水到爬上站臺所需時(shí)間，即逃避潛伏期。第7天行空間探索試驗(yàn)：拆去站臺，記錄120 s內(nèi)大鼠在原站臺所在象限(Ⅲ象限)的游泳時(shí)間和穿越站臺位置的次數(shù)。

1.2.3 免疫組化染色水迷宮實(shí)驗(yàn)后麻醉大鼠，自左心室插管灌注生理鹽水和10%中性甲醛以固定鼠腦，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋處理后，行鼠腦海馬冠狀位切片，片厚4～5 μm，每只大鼠切5張片。免疫組織化學(xué)SABC法檢測海馬齒狀回ChAT的表達(dá)，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。每張切片取5個(gè)視野，每個(gè)視野采集一幅圖像，計(jì)數(shù)ChAT免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)及測定平價(jià)光密度值，取其平均值作為最后結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件行單因素方差分析及S-N-K檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 行為學(xué)測試定向航行試驗(yàn)中逃避潛伏期模型組大鼠較對照組大鼠明顯延長(P<0.05)，而針刺組較模型組明顯改善(P<0.05)。見表1?？臻g探索試驗(yàn)中大鼠穿越站臺次數(shù)和第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間為：對照組(5.75±1.86)次和(49.27±6.53)s，模型組(1.00±0.64)次和(25.35±5.70)s，針刺組(3.35±1.20)次和(36.68±5.77) s；模型組與對照組比較(P<0.01)及針刺組與模型組比較(P<0.05)差異顯著。

2.2 海馬齒狀回ChAT的表達(dá) 對照組大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞數(shù)目多、排列緊密，其中有大量ChAT陽性神經(jīng)細(xì)胞分布，且胞質(zhì)內(nèi)有大量棕黃色陽性物質(zhì)；細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，胞體較大呈圓形或橢圓形，有的可見神經(jīng)元突起。模型組海馬齒狀回細(xì)胞嚴(yán)重脫失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，胞體固縮，染色較淡，ChAT陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少 (P<0.01)。針刺組陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較模型組增加(P<0.05)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)接近對照組。見圖1和表2。

組別第1天第2天第3天第4天第5天第6天對照組43.54±6.2127.85±8.9024.76±6.1418.91±5.1513.40±5.5612.10±4.50模型組54.72±7.411)52.78±7.452)43.29±4.912)39.47±4.752)34.93±3.742)33.77±10.482)針刺組49.18±7.0735.76±4.594)31.81±5.993)28.06±5.414)25.53±3.674)22.36±8.554)

與對照組比較：1)P< 0.05, 2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05, 4)P<0.01

圖1　各組大鼠海馬齒狀回ChAT陽性神經(jīng)細(xì)胞(SABC,×400)

組別細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)/視野)平均光密度值對照組62.21±6.1984.56±7.61模型組30.62±3.261)170.06±11.931)針刺組40.03±2.762)149.61±3.762)

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

3討論

腦反復(fù)缺血再灌注損傷和長期慢性低灌流是VD的主要發(fā)病原因〔1〕。本實(shí)驗(yàn)采用國際公認(rèn)的改良Pulsinelli 4-VO法，可逆性阻斷頸總動(dòng)脈血流并永久性灼斷椎動(dòng)脈，使大鼠腦處于長期低灌流狀態(tài)，致腦功能嚴(yán)重受損，制備出近似人類臨床發(fā)病特點(diǎn)的VD大鼠模型〔5〕。海馬結(jié)構(gòu)是參與學(xué)習(xí)和記憶功能的重要腦區(qū)，也是大腦極具可塑性但極易受損的一個(gè)腦區(qū)，對缺血缺氧極為敏感。美國心理學(xué)家Deutsch早在70年代初就提出“記憶膽堿能突觸假說”：記憶突觸就是膽堿能突觸，是學(xué)習(xí)記憶的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)〔6〕。海馬內(nèi)富含膽堿能神經(jīng)纖維投射，當(dāng)膽堿能神經(jīng)元受損時(shí)，腦內(nèi)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)——海馬環(huán)路就會受損，導(dǎo)致癡呆發(fā)生。乙酰膽堿作為神經(jīng)遞質(zhì)存在于膽堿能神經(jīng)元內(nèi)，是迄今發(fā)現(xiàn)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系極為密切的一種神經(jīng)遞質(zhì)〔7〕。 ChAT是細(xì)胞內(nèi)催化乙酰膽堿合成的關(guān)鍵酶，與乙酰膽堿的分布幾乎平行，常作為研究膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志或評估乙酰膽堿含量的間接指標(biāo)〔8〕。本實(shí)驗(yàn)采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均光密度值兩個(gè)指標(biāo)來評價(jià)ChAT在海馬齒狀回的表達(dá)，其中平均光密度值代表的是陽性表達(dá)部位的透光程度，其值大小與目標(biāo)物表達(dá)水平呈反比的關(guān)系。中醫(yī)將VD歸屬于“中風(fēng)”、“呆病”、“善忘”的范疇，認(rèn)為腎虛髓空為本，血瘀痰濁為標(biāo)〔4〕。祖國醫(yī)學(xué)很早就認(rèn)為，耳具有全身五臟六腑和肢體的縮影，帶有整體信息?！蹲C治準(zhǔn)繩》中有“腎為耳竅之主，心為耳竅之容”。刺激耳穴“腎”具有益精血、補(bǔ)腦髓、暢活氣血、固本培元之功；刺激耳穴“心”具有主血調(diào)神，疏通經(jīng)脈、活血止痛之功；加之針灸治療VD有多方面優(yōu)勢：降低血液黏度、促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立、改善腦缺血缺氧等作用〔3，9〕。本文結(jié)果表明針刺“腎”、“心”耳穴可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，可能與其促進(jìn)ChAT在腦的表達(dá)、保護(hù)膽堿能神經(jīng)元有關(guān)。

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〔2014-01-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

中圖分類號〔〕R338.64〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6712-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.029