鄧　放　趙不非　馬　躍　徐巖松　李　鵬　肖福斌　王宏升

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，吉林　吉林　132011)

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超氧化物歧化酶與L-精氨酸聯(lián)合預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用

鄧放趙不非馬躍徐巖松李鵬肖福斌王宏升

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，吉林吉林132011)

摘要〔〕目的觀察L-精氨酸(L-Arg)和超氧化物歧化酶(SOD)兩者分別應(yīng)用和聯(lián)合應(yīng)用在大鼠肝缺血再灌注損傷(I/R)中的作用及其機制。方法將大鼠隨機分為假手術(shù)組、I/R組、L-Arg預(yù)處理組(L-Arg組)、SOD預(yù)處理組(SOD組)、L-Arg和SOD聯(lián)合預(yù)處理組(L-Arg+SOD組)。治療組大鼠肝缺血前分別及聯(lián)合給予L-精氨酸和SOD ,再灌注后分別分析血液丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT), 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平；切取肝臟組織測一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量；組織病理學(xué)觀察肝細胞各種病理變化。結(jié)果治療組ALT、AST活性較I/R組有所降低(P<0.05)， L-Arg+SOD組降低更明顯(P<0.05)。和I/R組相比較，治療組eNOS的表達、NO的量增加(P<0.05)，誘導(dǎo)型NOS(iNOS)表達增加不明顯，和I/R組相比較卻有所降低，MDA含量顯著降低(P<0.05)，以上各項指標(biāo)在各治療組中均以L-Arg+SOD組變化更明顯(P<0.05)。I/R組示肝組織破壞明顯，治療組明顯改善。結(jié)論SOD與L-精氨酸均能夠?qū)Υ笫蟾蜪/R損傷具有保護作用，兩者聯(lián)用效果更好。

關(guān)鍵詞〔〕一氧化氮;超氧化物歧化酶;L-精氨酸;肝缺血再灌注損傷

第一作者：鄧放(1974-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腹腔鏡膽道外科研究。

缺血再灌注(I/R)損傷在肝臟手術(shù)特別是肝切除和肝移植手術(shù)中是比較常見的，常伴有微循環(huán)的障礙、組織壞死、細胞死亡等情況〔1〕。在這一過程中，氧化損傷起著非常關(guān)鍵的作用。超氧化物歧化酶(SOD) 作為一種氧自由基清除劑能夠減輕肝細胞I/R損傷,早已經(jīng)在動物實驗和臨床實踐中得到證實并廣泛應(yīng)用。近年研究表明，由I/R引起的肝細胞損傷，促發(fā)了一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，這中間一氧化氮(NO)扮演著關(guān)鍵的角色，由其產(chǎn)生的三個亞型在肝臟功能中都扮演著重要的角色〔2〕。先前的研究已經(jīng)證實了L-精氨酸(L-Arg,NO的前體)在NO介導(dǎo)路徑中的作用〔3〕。本研究評價SOD和L-精氨酸同時給藥對于I/R損傷模型鼠肝臟結(jié)構(gòu)和肝功能指標(biāo)的影響。

1材料和方法

1.1藥品及試劑L-精氨酸和外源性SOD購自上海普振生物科技公司；血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒、NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗動物及分組取健康活潑的大鼠50只(由北華大學(xué)動物實驗中心提供)，雌雄不限，質(zhì)量200～300 g，隨機分成5組，每組10只，術(shù)前12 h禁食，但可以飲水，分別為假手術(shù)組、I/R組、L-Arg預(yù)處理組(L-Arg組)、SOD預(yù)處理組(SOD組)、L-Arg和SOD聯(lián)合預(yù)處理組(L-Arg+SOD組)。SOD 用0.1 mol/L EDTA溶液(pH7.8)溶解，配成4 000 U/ml的溶液。缺血前予以SOD(2 000 U/100 g)及L-Arg(40 mg/100 g)腹腔內(nèi)注射給藥，假手術(shù)組和I/R組腹腔內(nèi)注射生理鹽水(0.5 ml/100 g)。

1.3動物模型制備稱重后按體重予烏拉坦(1.2 g/kg體重)腹腔注射麻醉，取上腹部正中切口，顯露肝門、肝蒂，分離肝動脈、門靜脈。采用Pringle氏法制備肝缺血再灌注損傷模型，用無損傷小動脈夾以0.9 N的閉合力阻斷肝十二指腸韌帶中的肝動脈、門靜脈和膽總管，造成全肝缺血；30 min后，松開動脈夾實行再灌注3 h，肉眼見肝臟由暗紅色變成鮮紅，表明再灌注成功。假手術(shù)組肝動脈和門靜脈暴露但不阻斷。

1.4取材及觀察指標(biāo)在再灌注結(jié)束后，用肝素管從下腔靜脈抽取5 ml血液。血液樣本在室溫下800 r/min離心10 min，分離出血漿用作分析丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT), 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨(AST)水平。切取肝臟組織放入-80℃冰箱保存，作為組織病理學(xué)研究和生化分析。取適量肝組織制成10%勻漿，用BCA法測總蛋白含量，硝酸還原酶法測NO含量，MDA試劑盒測MDA含量。組織病理學(xué)觀察取肝組織塊，經(jīng)固定后，脫水、浸蠟、包埋，制作4 μm切片，行HE染色，400倍電鏡視野下觀察肝細胞病理變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析和q檢驗。

2結(jié)果

2.1各組血清ALT、AST水平見表1。I/R組血清ALT、AST活性顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，L-Arg組和SOD組ALT、AST活性較I/R組有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； L-Arg+SOD組血清ALT、AST活性和SOD組及L-Arg組相比較降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

組別ALTAST假手術(shù)組30.3±12.328.6±10.3I/R組370.8±102.31)360.4±96.31)SOD組200.5±76.42)187.6±66.62)L-Arg組297.3±100.32)279.8±90.62)L-Arg+SOD組111.7±40.82)3)4)101.8±32.72)3)4)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與I/R組比較:2)P<0.05；與SOD組比較:3)P<0.05；與L-Arg組比較:4)P<0.05，下表同

2.2各組肝組織NOS，NO，MDA測定的結(jié)果I/R組內(nèi)皮型NOS(eNOS)的表達及NO含量和假手術(shù)組無顯著差異，而治療組eNOS的表達及NO含量顯著增加(P<0.05)。相反，誘導(dǎo)型NOS(iNOS)表達I/R組較假手術(shù)組顯著增加，治療組卻增加不明顯，但和I/R組相比較卻有所降低(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，I/R組小鼠肝組織MDA含量顯著升高(P<0.05)，和I/R組相比較治療組顯著降低(P<0.05)，以上各項指標(biāo)在各治療組中均以L-Arg+SOD組變化更明顯(P<0.05)。見表2。

2.3各組肝臟病理組織學(xué)結(jié)果假手術(shù)組有正常的肝組織結(jié)構(gòu)：肝索排列整齊，肝竇形態(tài)基本正常，無狹窄及擴張，肝細胞邊界清楚、形態(tài)無異常變化。I/R組示肝組織肝索排列明顯紊亂，肝竇形態(tài)不規(guī)則，竇狀隙充血，部分內(nèi)皮細胞脫落，有少量中性粒細胞浸潤。各治療組肝細胞結(jié)構(gòu)完整，肝細胞水腫較少，肝索排列可，肝竇形態(tài)較規(guī)則，僅有少量中性粒細胞浸潤及局灶的竇狀隙充血(見圖1)。

表2各組肝組織NOS、NO、MDA含量比較

組別eNOS(U/mgprot)iNOS(U/mgprot)NO(μmol/mgprot)MDA(nmol/mgprot)假手術(shù)組0.46±0.110.26±0.090.36±0.153.83±1.54I/R組0.51±0.150.51±0.221)0.41±0.1515.42±6.381)SOD組0.61±0.222)0.30±0.122)0.81±0.222)10.65±4.612)L-Arg組0.63±0.202)0.33±0.202)0.93±0.202)10.85±3.652)L-Arg+SOD組0.81±0.292)3)4)0.20±0.292)3)4)1.21±0.292)3)4)5.87±2.712)3)4)

圖1　各組肝組織病理改變(HE，×400)

3討論

肝臟移植、肝部分切除手術(shù)、處理嚴(yán)重的肝臟外傷時，都需要暫時性阻斷肝血流，重新恢復(fù)血液供應(yīng)后，可造成肝的缺血再灌注損傷。再灌注損傷是致手術(shù)后肝臟功能衰竭的重要原因之一。其病理生理過程復(fù)雜，迄今尚無明確認(rèn)識，故對其發(fā)生機制的研究已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點，如何減輕肝I/R損傷亦是目前肝臟外科特別是肝移植外科的研究熱點之一〔4〕。

氧化應(yīng)激損傷在包括器官移植在內(nèi)的I/R損傷中扮演重要的作用。缺血導(dǎo)致肝細胞出現(xiàn)快速的生化、結(jié)構(gòu)的改變，進而引起肝細胞功能變化。I/R損傷在主要器官促發(fā)一系列反應(yīng)。這些反應(yīng)通過細胞因子和炎性介質(zhì)的釋放引出一系統(tǒng)炎癥反應(yīng)(腫瘤壞死因子-α，白細胞介素6，血小板活性因子，白三烯和NO)并引起隨后的氧化應(yīng)激〔5，6〕。

在這方面，幾個研究已經(jīng)說明I/R損傷是和蛋白質(zhì)氧化修飾、線粒體損傷、脂質(zhì)過氧化作用有著密切聯(lián)系的。這種變化是一種自動催化機制，它導(dǎo)致了細胞膜的破壞損傷。進而導(dǎo)致毒素的產(chǎn)生、活性代謝產(chǎn)物和細胞的死亡。目前沒有方法用于治療肝臟的I/R損傷，只有通過預(yù)防才能夠減少或消除損傷的發(fā)生。

脂質(zhì)過氧化，作為一個獨立的損害因素，已經(jīng)被認(rèn)為和I/R損傷密切相關(guān)，MDA水平可以代表脂質(zhì)過氧化率的一個很好的指標(biāo)。和先前的結(jié)果相一致，我們的研究結(jié)果證實肝臟組織中的MDA水平在I/R后顯著增加。我們的結(jié)果也證實L-Arg和SOD可引起MDA水平的顯著降低，這些藥物可以引起保護性的反應(yīng)，并起到部分凈化劑的作用〔7〕。

在肝臟I/R損傷中，肝實質(zhì)損傷之前微循環(huán)紊亂是一個重要的因素。血管收縮物質(zhì)和血管舒張因子的不平衡導(dǎo)致了早期微循環(huán)的紊亂，NO、內(nèi)皮素 (ET)等起著重要作用。NO合酶(NOS)在體內(nèi)有3種異構(gòu)體:神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮細胞型(eNOS)和誘生型(iNOS)，iNOS 存在于激活的巨噬細胞和各型細胞，為非鈣和鈣調(diào)素依賴性的，生成的NO具有細胞毒作用，參與介導(dǎo)免疫反應(yīng)〔8〕。最新的證據(jù)表明iNOS是很多的細胞因子如腫瘤壞死因子α的促發(fā)因素，它產(chǎn)生大量的NO，在肝臟的病理生理學(xué)中還存有很多的爭議〔9〕。由eNOS產(chǎn)生的適度水平的NO有較好的血管擴張的活性，而由iNOS產(chǎn)生的高水平的NO與超氧陰離子相互作用能夠產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽陰離子，是導(dǎo)致肝臟氧化病理條件的潛在氧化物質(zhì)。此外，由iNOS產(chǎn)生的NO能夠誘導(dǎo)白細胞黏附、炎性細胞滲入和實質(zhì)細胞功能障礙。iNOS的過表達和多種慢性疾病有關(guān)。

在我們的研究中，我們觀測到iNOS表達I/R組較假手術(shù)組有顯著的增加，而治療組能夠減弱這種增加。在eNOS I/R組較假手術(shù)組沒有顯著的不同，而治療組和I/R組相比確有顯著的增加。以上變化均以L-Arg+SOD組最為顯著。本研究還發(fā)現(xiàn)在肝I/R損傷模型中，肝組織中的NO含量比假手術(shù)組略升高，可能為代償結(jié)果，而應(yīng)用L-Arg和SOD干預(yù)后，肝組織NO含量比I/R對照組明顯增高。eNOS與NO變化具有一致性。通過eNOS活性上調(diào)、iNOS活性降低、MDA含量減少，可推測L-Arg和SOD聯(lián)合應(yīng)用可能一方面通過適度影響血管內(nèi)皮細胞的功能，舒張血管改善微循環(huán); 另一方面抑制局部炎癥反應(yīng)，減輕氧自由基的損傷作用。

谷胱甘肽在氧化損傷中通過參與細胞防御系統(tǒng)對抗氧化損傷提供主要的保護作用。研究顯示各種刺激誘導(dǎo)的組織損傷和谷胱甘肽的缺乏有關(guān)，高水平的谷胱甘肽水平是減少氧化損傷起到很大的作用〔10〕。但是，在I/R損傷過程中的谷胱甘肽水平的減少是由于在氧化應(yīng)激中的大量消耗。血漿中肝臟大量酶的釋放也證實了再灌注伴隨著酶釋放的組織損傷。然而，在I/R損傷之后，血漿中的AST和ALT水平通過治療顯著減少，說明兩種藥物的聯(lián)合應(yīng)用具有較好的減少損傷的作用。另外兩種藥物的保護性作用通過組織學(xué)發(fā)現(xiàn)被證實，治療后的肝葉組織保持著原有的肝臟結(jié)構(gòu)，只有局部的充血和點狀壞死。

綜上所述，使用L-Arg和SOD干預(yù)后，I/R大鼠肝臟損傷減輕，可能是通過改善肝臟I/R后的微循環(huán)紊亂，減輕氧自由基對細胞的損傷所致。可以建議L-Arg和SOD能夠成為潛在的治療成分來對抗I/R誘導(dǎo)的氧化損傷。

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〔2015-09-17修回〕

(編輯曹夢園)

通訊作者：王宏升(1966-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事肝膽系統(tǒng)腫瘤研究。

基金項目：吉林市科學(xué)技術(shù)局基金項目(No.201233125)

中圖分類號〔〕R654. 1〔

文獻標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6710-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.028