熊兵紅　馬　利　程　勇　張才全

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，云南　昆明　400016)

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MicroRNA-21(miR-21)在大腸癌細胞中的表達及其靶基因

熊兵紅馬利1程勇2張才全2

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，云南昆明400016)

摘要〔〕目的探討微RNA(miRNA)-2l在大腸癌(CRC)細胞中的表達，抑制miRNA-21(miR-21)表達對大腸癌細胞中磷酸醋酶張力蛋白同源物(PTEN)、PI3K、蛋白激酶B(Akt)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、mTOR表達的影響及其可能調控的靶基因。方法通過反義寡核苷酸(ASO)技術抑制大腸癌細胞株HCT116中miR-21的表達并加以驗證。通過熒光定量PCR(FQ-PCR)技術及Western印跡法檢測HCT116細胞中PTEN 、PI3K 、Akt、MMP-9、mTOR表達的改變。利用生物信息學分析預測miRNA-21可能的靶基因，熒光素酶雙報告基因系統(tǒng)檢測PTEN活性。結果miR-21在HCT116中表達最高，在SW480中表達最低。miRNA-21在細胞株HCT116中的表達得到有效抑制，并且PTEN蛋白的表達明顯上調，PI3K 、Akt、MMP-9、mTOR表達下調。篩選并確認了PTEN為miR-21的調控靶基因之一。結論抑制miR-21的表達可促進HCT116細胞PTEN表達升高，PI3K、Akt、MMP-9、mTOR表達下調，PTEN可作為miR-21的靶基因參與調控過程。miRNA-21在CRC中表達失控，通過抑制PTEN表達促進腫瘤細胞侵襲轉移。

關鍵詞〔〕大腸癌； miR-21； 腫瘤抑制基因；PTEN；Akt；MMP-9

1綿陽市第三人民醫(yī)院2重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

第一作者：熊兵紅(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃腸道腫瘤的臨床及基礎研究。

在美國，大腸癌(CRC)在人群中的發(fā)病率和致死率均處于第三位〔1〕。而在我國，排在惡性腫瘤和致死因素的第四位〔2〕?，F在認為，CRC的發(fā)生是一個多因素、多階段和多基因改變協同作用的過程，癌基因和抑癌基因的表達失調是CRC發(fā)生的分子基礎。miRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，很可能是一類潛在的癌基因或抑癌基因〔3〕。研究發(fā)現miR-21在人類多種腫瘤組織中表達上調，例如子宮頸癌、卵巢癌、肺癌、膽管癌、前列腺癌、乳腺癌 、腦膠質瘤、肝癌、胰腺癌、胃癌、B細胞淋巴瘤、白血病等，并可能參與腫瘤的浸潤轉移。本研究擬通過反義寡核苷酸(ASO)技術抑制CRC細胞株HCT116中miR-21的表達，觀察其對PI3K/PTEN/AKT/mTOR信號通路中各蛋白的影響。

1材料與方法

1.1結腸癌細胞株結腸癌細胞系HCT116、SW480、HT29、Lovo、Colo32細胞由本實驗室保存?zhèn)鞔?/p>

1.2主要試劑含10%小牛血清的RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，CCK-8試劑購自日本Dojindo 公司，LipofectamineTM2000轉染試劑購自Invitrogen公司，miR-21抑制劑及其陰性對照品購于美國Ambion公司，引物由上海生工生物工程公司合成。總RNA 提取試劑盒，反轉錄試劑購自TaKaRa 公司。MiR-21 qPCR檢測試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM，磷酸酯酶張力蛋白同源體(PTEN)mRNA qPCR檢測試劑盒 Quantitect SYBR Green PCR kit均購自大連Takara公司。PTEN、蛋白激酶B(p-AKT)、PI3K、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、 p-mTOR抗體購自Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗、兔抗人β-actin及ECL發(fā)光試劑盒均購自Santa Cruz公司。BCA法蛋白質定量試劑盒購自海門碧云天公司。pGL3-contro 質粒、熒光素酶雙報告基因檢測系統(tǒng)均購自Promega公司。

1.3研究方法

1.3.1細胞培養(yǎng)HCT116、SW480、HT29、Lovo、Colo32用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細胞株均使用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期的細胞進行試驗。

1.3.2細胞轉染將HCT116細胞經過0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期HCT116細胞2×105個接種于6孔板，按試驗設計分別轉染miR-21抑制組、陰性對照組和空白對照組。分別用250 μl無血清RPMI-1640稀釋LipofectamineTM2000轉染試劑8 μl和miR-21 inhibitor/NC/PBS12.5 μl，室溫靜置5 min，然后將轉染試劑分別與稀釋miR-21 inhibitor/NC/PBS混合，室溫下靜置20 min后，分別鋪到6孔板中的實驗組、陰性對照組和空白對照組(轉染HCT116細胞用無血清DMEM)，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，供后續(xù)試驗使用。

1.3.3實時熒光定量PCR(RFQ-PCR)分別檢測miR-21、PTEN mRNA：按Trizol說明書抽提總RNA。分別測定RNA在分光光度計280 nm、 260 nm和230 nm的吸收值，計算濃度并評估純度。按照試劑盒說明書分別測定miR-21、PTEN mRNA。miR-21以U6snRNA為內參照，PTEN以β-actin為內參照。

1.3.4Western印跡蛋白印跡試驗轉染后72 h分別進行細胞裂解收集蛋白，行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉至硝酸纖維素膜上，常規(guī)抗體雜交，增強化學發(fā)光劑顯色。用Bio-Rad凝膠成像儀顯色儀行發(fā)光檢測，Quantity One 軟件顯色凝膠圖像的光密度值。以β-actin蛋白為內參照，以PTEN條帶與β-actin條帶光密度值的比值表示。實驗數據均重復3次，求其均值與標準差。

1.3.5熒光素酶試驗根據生物信息學軟件多種miRNA靶基因在線分析軟件，如TargetScan、miRanda、MiRbase 、Pictar等，預測miR-21可能的靶基因，并獲取含有作用位點的片段序列。預測設計引物，PTEN-3′-UTR-WT：上游為5′-TTGTGGCAACAGATAAGTTTGCAGTTGGCTAAGAGAGGTT-3′，下游為5′-CATTCCCCTAACCCGAATACATGCAT-TAGAATGTAGCAAA-3′；PTEN-3′-UTR-MT：上游為5′-TTGTGGCAACAGCTGAATCT GCAGTTGGCTAAGAGAGGTT-3′，下游為5′-ATGTAGCAAAACCCTTCGGAAACCTCTCTTAGCCAACTGC-3′。擴增出包含有miR-21 保守性結合位點的3′-UTR-WT及3′-UTR-MT，擴增產物凝膠電泳，然后行目的基因切膠回收， 再行目的基因和載體的連接， 構建pGL3-PTEN-3′-UTR 和PTEN-3′-UTR-MT 載體，再依次行轉化感受態(tài)菌、目的基因測序、質粒DNA 抽提，將重組質粒轉染293T 細胞，然后行雙熒光素酶分析和統(tǒng)計分析。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件行t檢驗及單因素方差分析。

2結果

2.1miR-21在大腸癌細胞中的表達miR-21在HCT116中表達最高(1.02±0.01)，在SW480中表達最低(0.32±0.02)，在HT29、Lovo、Colo32中表達量分別為(0.38±0.01)、(0.57±0.02)及(0.62±0.01)。

2.2PTEN蛋白在大腸癌細胞中的表達Western印跡分析表明PTEN蛋白在HCT116中表達最低，在SW480中表達最高。經統(tǒng)計表明，miR-21和PTEN蛋白表達水平呈反比(P<0.01)。見圖1。

圖1　PTEN蛋白在各大腸癌細胞中的表達

2.3miR-21下調后在HCT116細胞中的表達miR-21在轉染抑制組及陰性對照組、空白對照組中的相對表達量分別為0.643±0.01、1.02±0.01、1.05±0.02。抑制組miR-21表達水平則明顯低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。

2.4miR-21下調后PTEN mRNA和蛋白在HCT116細胞中的表達miR-21下調后，PTEN mRNA的表達量在轉染抑制組及陰性對照組(NC)、空白對照組(MOCK)中相對表達量分別為(1.01±0.01)、(1.02±0.01)、(1.01±0.01)，三組間無明顯差異(P>0.05)。PTEN蛋白在IN、NC及MOCK組中相對表達量分別為1.03±0.01、1.02±0.01、2.02±0.01，在IN組中明顯升高(P<0.05)。

2.5下調miR-21 表達后對PTEN 及其下游蛋白表達量的影響PTEN蛋白在轉染抑制組及陰性對照組、空白對照組中的相對表達量分別為1.02±0.07、1.03±0.09 和2.01±0.12，在抑制組表達明顯升高(P<0.05)。而p-AKT(1.01±0.01 vs 0.99±0.01 vs 0.48±0.02)、PI3K(1.02±0.02 vs 0.98±0.02 vs 0.56±0.01)、MMP-9(1.02±0.02 vs 1.01±0.01 vs 0.64±0.01)、p-mTOR(0.99±0.01 vs 1.02±0.01 vs 0.55±0.02)在抑制組中表達量均下降(均P<0.05)，見圖2。

2.6下調miR-21后熒光素酶相對活性(PTEN活性)改變PTEN-3′-UTR-WT共轉染組，轉染miR-21inhibitor后熒光素酶相對活性(0.52±0.15 vs 1.13±0.10)明顯增加，與對照組(0.52±0.15)及PTEN-3′-UTR-MT組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；PTEN-3′-UTR-MT組轉染miR-21inhibitor后，熒光素酶相對活性(0.48±0.01)與對照組(0.49±0.15)比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，表明PTEN是miR-21的一個靶基因。

圖2　信號通路中各蛋白在大腸癌細胞HCT116中的表達

3討論

目前研究認為，CRC發(fā)生、發(fā)展是多因素、多階段、多因子的復雜過程，在此過程中癌基因的激活與抑癌基因的丟失或表達失調是其重要特征。 miRNA是近年發(fā)現的一類內源性非編碼單鏈RNA，miRNAs與腫瘤的發(fā)生密切相關，有人提出了“癌miRNAs與抑癌miRNAs”的觀點〔3，4〕，即miRNAs在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中既可扮演癌基因也可扮演抑癌基因的角色。miR-21是miRNA中具有代表性的基因，miR-21是一種癌基因，它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色，在不同腫瘤中表達明顯上升，與腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲轉移等生物學行為密切相關。它的編碼基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(VMP1)編碼區(qū)，VMP1基因的第十內含子。PTEN是一個抑癌基因，在細胞的生長發(fā)育、凋亡、遷移、信號傳遞等方面起著重要的調控作用，而且在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉移中均起抑制作用〔5〕。PI3K/ PTEN/AKT/ mTOR信號傳導通路在調節(jié)細胞的凋亡、增生、分化等活動中起著重要的作用，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。PTEN作為一種具有雙重磷酸酶活性的蛋白，可依賴其蛋白磷酸酶活性去磷酸化，也可依賴其脂質磷酸酶活性使磷酸肌醇三磷酸的D3位脫磷酸，從而阻斷AKT的作用，阻止細胞進行分裂，并導致細胞凋亡。PTEN的突變將使PI3K增加，AKT活性增強。Akt又稱為蛋白激酶B(PKB)，PTEN通過控制活化的磷脂酰3，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)來調控 Akt的活性。因此，PTEN的突變使其喪失了調節(jié)Akt的能力，使細胞增殖失去控制，從而引起癌變。PTEN功能的下調會引起PI3K 信號通道下游包括Akt等元件的激活，從而介導腫瘤的進展和遠處轉移〔6〕。PI3K/AKT/PTEN/ mTOR信號傳導通路活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡，促進細胞周期進展，從而促進細胞的生存和增殖，同時參與血管形成，在腫瘤的形成中扮演重要角色，并參與腫瘤的侵襲和轉移。Meng 等〔7，8〕最早發(fā)現，miR-21可以在膽管癌、肝癌細胞中作用于腫瘤抑制基因PTEN 并促進腫瘤細胞侵襲和遷移，證明PTEN是 miR-21的靶基因，后陸續(xù)在非小細胞肺癌〔9〕和 乳腺癌〔10〕、胃癌〔11〕、卵巢癌〔12〕、腦膠質瘤〔13〕、子宮內膜癌〔14〕中被證明是miR-21 的靶基因。Meng等〔7〕在膽管癌的研究中，證明了抑癌基因PTEN是miR-21的一個靶基因，miR-21通過靶向作用于PTEN，促進了膽管癌的生長。Meng等〔8〕通過miRNA 表達譜研究發(fā)現人肝癌細胞中存在miR-21過高表達，而PTEN表達降低，兩者之間存在負相關趨勢，提示miR-21可能抑制PTEN的表達從而介導了腫瘤的進展。抑制miR-21可增加PTEN 表達，減少肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移，增強miR-21表達的作用則出現相反的腫瘤生物學效應，表明PTEN是miR-21的直接靶基因，其參與了miR-21對腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的影響。Zhang等〔11〕發(fā)現，在胃癌細胞BGC-823中，miR-21可通過靶向PTEN促進細胞的增殖和侵襲。許多研究已經表明miR-21在CRC中高表達〔15～20〕，但miR-21在CRC中的具體調節(jié)機制尚不明了。miRNA 具有調節(jié)下游靶基因表達的作用，因此在大多腫瘤中高表達的miR-21 很可能是通過調節(jié)同增殖、凋亡、侵襲或遷移相關基因的表達而發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

本研究先通過生物信息學在線軟件查詢PTEN是miR-21的一個靶基因，后通過熒光素酶實驗更加進一步證實。抑制miR-21后，PTEN mRNA變化無差異，但PTEN蛋白則明顯增高，證明miR-21在轉錄后水平調控PTEN表達。抑制miR-21后，PTEN其下游的PI3K、AKT、mTOR、MMP-9水平均降低。miR-21改變了病灶中黏附激酶的磷酸化和金屬蛋白酶2和9(MMP-2、MMP-9)的表達，進而抑制了其下游的遷移和浸潤。證明miR-21可通過對PTEN的調控進而影響PI3K/AKT/ mTOR信號通路下游的靶點蛋白的表達。但也有不一致的報道，Medina 等〔21〕通過裸鼠試驗證明僅僅過表達miR-21 就可引發(fā)腫瘤的發(fā)生， Hatley 等〔22〕卻通過體外實驗證明miR-21 過表達并不能導致腫瘤的發(fā)生，在非小細胞肺癌中PTEN并非miR-21的靶標。Cheng等〔23〕報道在HeLa細胞中抑制miR-21時，HeLa細胞會顯著加快生長。Si等〔24〕在乳腺癌細胞MCF-7中的研究發(fā)現，MCF-7細胞中miR-21與PTEN并不存在這樣的調節(jié)關系。Folini等〔25〕研究發(fā)現敲除前列腺癌細胞中miR-21表達，不影響其增值、侵襲能力和放化療敏感性，也不調節(jié)腫瘤抑制因子PTEN、PDCD-4的表達，也發(fā)現miR-21在前列腺癌組織和相應的正常組織表達也沒有差異。表明miR-21的致癌屬性存在細胞和組織依賴性。特定的miRNA作為治療靶點應該考慮疾病的有關環(huán)境背景。Wang等〔26〕發(fā)現miR-21在 Cdc25A過表達的結腸癌細胞中低表達。原因可能在于組織樣本的數量和質量，或者特定的細胞株或者培養(yǎng)條件。這表明miRNAs可能參與許多與腫瘤形成、炎癥、細胞生長密切相關的信號途徑，形成一個復雜的網絡?？梢姡藗儗iR-21 的作用及其與PTEN 的關系還沒有達成共識，故需要進一步研究。

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采用口服自擬中藥湯劑降脂湯，方劑如下：黃芪30 g、生大黃6 g、白芍15 g、草決明20 g、山楂20 g、澤瀉10 g、紅花15 g、炒白術20 g，茯苓20 g，枳實10 g、丹參20 g，肝腎虧虛加：何首烏10 g、女貞子10 g、桑寄生15 g、杜仲10 g；脾虛痰濕加：半夏6 g、膽南星10 g、薏苡仁20 g、山藥10 g；氣滯血瘀加：紅花10 g、桃仁10 g、當歸10 g、陳皮15 g。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

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The expression and function research of MicroRNA-21(miR-21) in colorectal cell lines

XIONG Bing-Hong, MA Li, CHENG Yong,etal.

Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Key Laboratory of General Surgery of Chongqing City, Chongqing 400016, China

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of miRNA-21 ( miR-21) in colorectal cancer (CRC), discuss the potential role of miR-21 playing on target mRNA regulation.MethodsThe ASO technology was employed to suppress the expression of miR-21 in HCT116 cells. The changes in PTEN, PI3K, Akt, MMP-9, mTOR mRNA and protein expressions were detected by FQ-PCR and Western blot respectively. The potential target mRNA prediction was performed by Bioinformatics. Dual report gene assay was used to identify the target gene of miR-21.ResultsThe level of miR-21 was the highest in HCT116 cell, lowest in SW480 cell. The suppression of miR-21 could lead to the increment of PTEN protein, the down-regulation of PI3K, Akt, MMP-9 and mTOR. PTEN was identified as one of target genes of miR-21 in CRC cell.ConclusionsmiR-21 is over-expressed in CRC and can promot cancer cell invasion by inhibiting the expression level of PTEN.

【Key words】Colorectal cancer; miR-21; Tumor suppressor gene; PTEN; Akt; MMP-9

中圖分類號〔〕R735.3〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6688-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.019