涂小麗，　陳　琦，　張洪洲，　鄢瑞娟，　吳延慶

(南昌大學第二附屬醫(yī)院心血管內科，江西 南昌 330006)

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CXCR7在動脈粥樣硬化模型ApoE-/-小鼠的表達及阿托伐他汀的干預作用*

涂小麗，陳琦，張洪洲，鄢瑞娟，吳延慶△

(南昌大學第二附屬醫(yī)院心血管內科，江西 南昌 330006)

[摘要]目的： 研究CXC趨化因子受體7(CXC chemokine receptor 7，CXCR7)在動脈粥樣硬化模型載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠中的表達并探究阿托伐他汀的干預作用。方法: 8周齡ApoE-/-雄性小鼠，隨機分為正常對照組、高脂組與高脂+阿托伐他汀組，實驗干預12周建立動脈粥樣硬化模型；油紅O及HE染色觀察動脈粥樣硬化病變，Western blot及免疫組化法檢測動脈CXCR7的表達，Western blot檢測動脈eNOS和Akt的表達。結果: (1)動脈油紅O及HE染色示高脂組可見有明顯粥樣核心及纖維帽的顯著斑塊，高脂+阿托伐他汀組也可見斑塊，但斑塊負荷較模型組減輕，正常對照組未見明顯斑塊形成；(2)免疫組化示高脂組動脈細胞著色淺，CXCR7表達量少，高脂+阿托伐他汀組與高脂組比較，細胞著色增加，CXCR7表達量增加，正常對照組顆粒呈深棕黃色，示CXCR7大量表達；(3)Western blot結果示高脂組CXCR7、eNOS和Akt的表達較正常對照組降低，給予阿托伐他汀干預后CXCR7、eNOS和Akt的表達較高脂組增加，較正常對照組相比CXCR7、eNOS和Akt的表達下降，但磷酸化eNOS的水平未見差異。結論: 高脂血癥可損傷血管內皮，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展，下調動脈CXCR7、eNOS和Akt的表達；阿托伐他汀可改善動脈粥樣硬化，緩解ApoE-/-小鼠動脈CXCR7、eNOS和Akt蛋白表達的下調。

[關鍵詞]動脈粥樣硬化； 載脂蛋白E； CXC趨化因子受體7； 阿托伐他汀

趨化因子是一類8～12 kD的小分子多肽類物質，是一種強有力的化學誘導物，能誘導成熟與未成熟造血細胞的增殖與分化，促進干細胞的增殖、生存及歸巢，參與多種病理生理過程[1]?；|細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1),也稱CXC趨化因子12(CXC chemokine 12，CXCL12)，是一個多效性的趨化因子并廣泛表達于多種組織中，在許多重要的生命過程中發(fā)揮著作用，如在缺氧復氧性腦損傷的大鼠中，通過調節(jié)間充質干細胞CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)的表達可調控間充質干細胞的遷移，進而起到保護作用[2]。此外在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病變中，CXCL12的受體CXCR4能通過調節(jié)中性粒細胞的遷移預防AS的發(fā)展[3]；在內膜損傷的修復過程中，CXCL12對平滑肌祖細胞(smooth muscle progenitor cells，SPCs)的動員聚集加重了內膜增生，但是在系統(tǒng)給予CXCL12藥物治療時，SPCs的動員反而能起到穩(wěn)定斑塊的作用，表明CXCL12及其受體CXCR4對于AS病變的保護性效應[4]。以上研究表明了CXCL12與其受體CXCR4的生物學效應，但關于CXCL12的另一個受CXCR7在AS中的作用機制卻仍不明確。本研究通過動脈粥樣硬化模型小鼠，探討AS與 CXCR7 的關系以及阿托伐他汀干預的影響。

材料和方法

1實驗動物

8周齡雄性ApoE-/-小鼠，SPF級，體重18～22 g，購于愛爾麥特科技有限公司。

2主要試劑

動脈粥樣硬化疾病模型的誘導飼料(江蘇美迪森公司)；阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司)；CXCR7 多克隆抗體、eNOS單克隆抗體(Abcam)；phospho-eNOS抗體(Affinity)；phospho-Akt多克隆抗體(CST)；血清總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒(中生北控生物科技公司)。

3主要方法

3.1動脈粥樣硬化模型的建立及實驗分組36只ApoE-/-小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h，采用眼眶后靜脈叢采血0.5 mL左右，室溫靜置離心取上清。隨后將小鼠隨機分為正常對照組、高脂組和高脂+阿托伐他汀組，其中正常對照組給予常規(guī)齲齒類動物飼料，高脂組及高脂+阿托伐他汀組則給予高脂飼料，而高脂+阿托伐他汀組在給予高脂飼料4周后開始阿托伐他汀(10 mg·kg-1·d-1)灌胃干預治療，其它組則予同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃9周，共喂養(yǎng)高脂飼料12周。干預結束后，給予10%水合氯醛0.07 mL腹腔注射麻醉，摘眼球取血法采血，離心分離血清。取主動脈根部至髂總動脈分叉處整條動脈，一部分經多聚甲醛固定，一部分則液氮速凍，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

3.2血脂檢測根據(jù)試劑盒說明書測定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，其中TC和TG檢測采用酶法，LDL-C和HDL-C采用選擇性沉淀法測定。

3.3動脈HE染色將標本進行常規(guī)石蠟包埋，切片，采取蘇木精-伊紅(HE)染色、經無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

3.4主動脈整體油紅O染色分離主動脈外膜脂肪組織，4%多聚甲醛固定過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，異丙醇脫水數(shù)分鐘，室溫下經油紅O染色4 h(避光)，再經70%異丙醇沖洗4次，每次5 min，PBS沖洗干凈并將動脈伸展開，行數(shù)碼拍照。

3.5免疫組化法主動脈組織切片脫蠟后，置于PBS中，經抗原修復液高溫修復(5 min×3次)，Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)清洗2次，3%過氧化氫溶液室溫10 min，清除內源性過氧化物酶，TBS清洗3次，血清封閉液封閉1 h，滴加抗CXCR7多克隆抗體(1∶100)4 ℃過夜，添加 II 抗1 h，DAB 染色，蘇木精復染，中性樹膠封固。

3.6Western blot實驗取出動脈組織置于冰上，加入液氮研磨，裂解液裂解60 min后離心取上清得到樣品，測定蛋白濃度。蛋白在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，并經濕轉法轉移到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，結合 I 抗(CXCR7多克隆抗體，濃度為1∶1 500；β-tubulin單克隆抗體，濃度為1∶1 000；eNOS單克隆抗體，濃度為1∶500；p-eNOS抗體，濃度為：1∶500；p-Akt多克隆抗體，濃度為1∶1 000)，4 ℃過夜，TBST 漂洗3 次，滴加辣根酶標記的羊抗兔IgG II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3 次，并ECL發(fā)光顯影攝片。

3.7一氧化氮的檢測根據(jù)一氧化氮檢測試劑盒說明書測定血清中NO的濃度。

4統(tǒng)計學處理

經SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1血脂檢測

3組小鼠的基礎血脂水平示各組小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C無明顯差異；經高脂飲食干預12周后高脂組小鼠血清TC、TG和LDL-C水平較正常對照組明顯升高(P<0.05)，HDL-C水平明顯低于正常對照組(P<0.05)；經阿托伐他汀干預后小鼠血清TC、TG和LDL-C水平較高脂組下降(P<0.05)，HDL-C水平較高脂組升高(P<0.05)；高脂+阿托伐他汀組與正常對照組之間血脂水平的差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1ApoE-/-小鼠基礎血脂及高脂飲食或阿托伐他汀干預后血脂水平

Table 1.Blood lipid concentration ofApoE-knockout mice before or after treated with high-fat diet (HFD) or atorvastatin (Sat). (mmol/L. Mean±SD.n=12).

TimepointGroupTCTCLDL-CLDL-C9weeksNDC12.60±1.711.21±0.351.56±0.631.64±0.71HFD10.79±4.631.35±0.571.66±0.681.42±0.60HFD+Sat11.75±3.501.39±0.451.64±0.781.45±0.6921weeksNDC10.71±2.651.39±0.351.56±0.351.97±0.42HFD21.37±4.50*2.76±0.56*4.40±0.94*0.82±0.30*HFD+Sat11.82±4.00#1.43±0.56#1.83±0.75#1.69±0.47#

NDC: normal diet control.*P<0.05vsNDC;#P<0.05vsHFD.

2病理學形態(tài)觀察

主動脈弓HE染色示高脂組小鼠主動脈內可見有粥樣核心及纖維帽的顯著斑塊，高脂+阿托伐他汀組也可見泡沫細胞以及典型的粥樣斑塊，但斑塊少于高脂組，正常對照組內膜完整，未見泡沫細胞的聚集及AS斑塊的形成，見圖1。主動脈整體油紅O染色示高脂組紅染脂質斑塊明顯，高脂+阿托伐他汀組也可見斑塊，但較模型組斑塊負荷輕，正常對照組內膜光滑，僅在主動脈弓處可見極少量紅染斑塊，各組之間斑塊相對面積(斑塊面積/血管整體面積)比較示高脂組及高脂+阿托伐他汀組小鼠AS斑塊相對面積高于正常對照組(P<0.05)，且高脂+阿托伐他汀組較高脂組也有減少(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.Representative sections ofApoE-knockout mice aortas (HE staining，×200).

圖1主動脈弓HE染色

3免疫組化檢測

主動脈弓免疫組化提示CXCR7表達陽性時呈棕黃色顆粒，正常對照組小鼠主動脈組織中CXCR7表達量較多，呈深棕黃色的顆粒，細胞著色較深，高脂組及高脂+阿托伐他汀組較對照組表達量減少，細胞著色較淺，平均吸光度值降低(P<0.05)，經阿托伐他汀治療后高脂+阿托伐他汀組細胞著色較高脂組增強(P<0.05)，見圖3。

4Western blot檢測動脈組織CXCR7、p-Akt和eNOS的蛋白水平

4.1CXCR7的表達經高脂刺激后小鼠主動脈CXCR7的表達明顯低于正常對照組(P<0.05)，他汀藥物治療后，CXCR7的表達仍低于正常對照組(P<0.05)，但與高脂組相比有所增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.Oil red O staining for lipids within the wall of atherosclerotic aortas fromApoE-knockout mice and the measurement of lipid stained area in the aortas. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNDC;#P<0.05vsHFD.

圖2主動脈整體油紅O染色及相對斑塊面積比

Figure 3.The protein expression of CXCR7 in the aortas ofApoE-knockout mice (immunohistochemistry,×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNDC;#P<0.05vsHFD.

圖3免疫組化檢測主動脈CXCR7的表達情況

Figure 4.The protein expression of CXCR7 in the aortas ofApoE-knockout mice detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNDC;#P<0.05vsHFD.

圖4Western blot檢測動脈組織CXCR7蛋白的表達

4.2p-Akt的蛋白水平經高脂干預后小鼠動脈組織p-Akt的蛋白水平明顯低于正常對照組(P<0.05)，阿托伐他汀藥治療后，小鼠主動脈p-Akt的蛋白水平雖低于正常對照組(P<0.05)，但與高脂組相比仍有增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The protein levels of p-Akt in the aortas ofApoE-knockout mice detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNDC;#P<0.05vsHFD.

圖5Western blot檢測動脈組織p-Akt蛋白的表達

4.3eNOS的蛋白水平經高脂干預后小鼠動脈組織的eNOS及p-eNOS的蛋白水平明顯低于正常對照組(P<0.05)，阿托伐他汀治療后，小鼠主動脈eNOS和p-eNOS的蛋白水平較高脂組明顯增加(P<0.05)，但與正常對照組相比eNOS仍明顯降低(P<0.05)，而p-eNOS的蛋白水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。

Figure 6.The protein levels of eNOS and p-eNOS in the aortas ofApoE-knockout mice detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNDC;#P<0.05vsHFD.

圖6Western blot檢測動脈組織p-eNOS和eNOS蛋白的水平

5血清NO的濃度測定

高脂干預后小鼠血清NO的濃度明顯低于正常對照組(P<0.05)，阿托伐他汀干預治療后，小鼠NO的生成較高脂組明顯增加(P<0.05)，但與正常對照組相比差異無統(tǒng)計意義，見圖7。

Figure 7.The concentration of NO in the plasma ofApoE-knockout mice. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsNDC;#P<0.05vsHFD.

圖7血清中一氧化氮的濃度

討論

動脈粥樣硬化性疾病是一種慢性炎癥性疾病，是多因素導致的老年性疾病，其中冠狀動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎，而血脂異常與其關系非常密切。研究表明ApoE基因敲除小鼠經過高脂飲食誘導后可形成嚴重的AS，且與人類粥樣斑塊的相似性較高[5]。本實驗通過對ApoE-/-小鼠進行高脂飲食干預后小鼠血清血脂代謝出現(xiàn)明顯異常，血清TC、TG和LDL-C水平升高，HDL-C降低；且小鼠動脈HE染色及油紅O染色均可見粥樣斑塊形成，斑塊負荷明顯，成功建立了動脈粥樣硬化動物模型小鼠。

CXCL12是一個多效性的趨化因子，既往認為其唯一受體是CXCR4，但Balabanian等[6]于2005年發(fā)現(xiàn)SDF-1的另一個受體CXCR7，其與配體CXCL12結合的親和力比CXCR4高10倍左右。與CXCR4相比，CXCR7是一個非典型性趨化因子受體，其不激活細胞內的G蛋白偶聯(lián)信號通路，而是通過誘導β-抑制蛋白2的聚集，導致受體的內化或者下游信號通路的激活，進而促進細胞的生長與黏附[7]。

在成年的ApoE-/-小鼠中，條件性的CXCR7基因缺陷，并給予損傷頸動脈及高脂飲食干預后，發(fā)現(xiàn)在受損的部位有明顯的內膜增生及巨噬細胞的堆積，而給予CXCR7人工配體CCX771能夠明顯改善高脂血癥誘導的血管損傷及斑塊的形成[8]。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)高血壓患者循環(huán)中CXCR7的水平較正常人低，而下調CXCR7的表達可以激活p38 MAPK信號通路，誘導內皮祖細胞caspase-3的表達，進而降低內皮祖細胞的黏附及增殖，損傷內皮祖細胞對高血壓患者損傷內皮的修復作用。而在本實驗中同樣發(fā)現(xiàn)在高脂組中小鼠動脈組織在受到高脂因素損傷后，不僅促進了AS的發(fā)展，同時也下調了動脈組織CXCR7的表達，表明CXCR7在AS發(fā)展過程中起到保護性效應，可以改善高脂對血管的損傷。

阿托伐他汀被廣泛用于治療及預防高脂血癥與冠心病，除可降低低密度脂蛋白膽固醇之外，許多研究表明阿托伐他汀還可以改善AS病變的炎癥性改變，促進細胞生存等效應[10]。如在心肌梗死小鼠模型中發(fā)現(xiàn)短期服用阿托伐他汀能夠增加受損心肌細胞CXCR4的表達，并進一步引起eNOS/NO信號通路的激活起到抗炎及抗凋亡效應[11]，在本實驗中發(fā)現(xiàn)小鼠動脈組織CXCR7表達與阿托伐他汀的干預呈正相關，經他汀干預后可以改善高脂損傷導致的CXCR7表達下降的情況，使其表達量較高脂組增加，推測阿托伐他汀改善AS病變可能與CXCR7的表達相關，他汀可能通過調節(jié)趨化因子受體的表達改善高脂對血管的損傷。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，分布于多種細胞內，其可通過磷酸化產生磷脂酰肌醇，并與蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)結合，使Akt從細胞質轉移到細胞膜，進而激活下游信號通路，對細胞進行調節(jié)。在內皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)上調PI3K/Akt信號通路能夠改善氧化低密度脂蛋白導致的內皮損傷，抑制氧化應激、黏附分子等的表達，而PI3K、Akt或eNOS的抑制劑能明顯抑制藥物對內皮細胞的保護效應[12]，表明影響細胞PI3K/Akt信號通路的激活能夠調節(jié)氧化低密度脂蛋白對細胞造成的損傷作用。而多數(shù)研究表明CXCR7能夠調節(jié)PI3K/Akt信號通路促進細胞的存活，如T細胞中CXCL12/CXCR7通過與ERK 或Akt信號通路相互作用可以促進T細胞的存活[13]；此外，血小板來源的巨噬細胞移動抑制因子也能夠上調血小板表面CXCR7的表達，進而激活PI3K/Akt信號通路，延遲血小板的存活以及減少磷脂酰絲氨酸的暴露而調節(jié)血栓形成[14]。這些表明CXCR7可能通過PI3K/Akt信號通路調節(jié)細胞的凋亡，PI3K/Akt信號通路是CXCR7的一個下游調節(jié)通路機制。在本實驗中高脂飲食損傷血管并下調動脈組織Akt蛋白的表達，而他汀干預后Akt的表達下調有所緩解，因此考慮動脈組織CXCR7蛋白的表達上調可能通過激活細胞PI3K/Akt信號通路，進而改善高脂血癥導致的內皮損傷，氧化應激以及炎癥損傷等情況，改善AS的進展，但這還需要通過進一步的研究進行論證。

內皮細胞功能障礙是AS病變形成的關鍵起始因素，而內皮功能在很大程度上依賴內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達，由eNOS合成的一氧化氮(nitric oxide，NO)能抑制內皮細胞黏附分子的表達、細胞增殖、遷移，調節(jié)血管張力及血小板的激活等。因此上調eNOS表達促使NO的生成對改善AS非常重要。Akt是細胞生存的調節(jié)點，是PI3K的下游效應器。許多因素都能夠通過PI3K/Akt信號通路激活eNOS活性，增加細胞NO的產生，調節(jié)細胞的增殖、遷移、存活與血管增生；既往研究證明Akt主要通過磷酸化eNOS的Ser 1177位點，提高eNOS的酶活性，進而促進NO的生成[15]。在缺氧誘導的內皮細胞凋亡中，SDF-1/CXCR4上調能夠減少細胞凋亡，而PI3K或eNOS的抑制劑的加入可以阻礙其抗凋亡效應，表明SDF-1/CXCR4通過PI3K/Akt/eNOS的激活保護細胞[16]。在本實驗中，高脂飼養(yǎng)導致ApoE-/-小鼠血管內皮損傷及AS病變的發(fā)生，使動脈CXCR7、eNOS及Akt蛋白的表達減少；而阿托伐他汀干預后緩解了ApoE-/-小鼠動脈組織CXCR7、Akt及eNOS的蛋白下降的情況，增加eNOS的活性及NO的釋放，改善AS病變的進展，因此推測阿托伐他汀可能通過上調CXCR7的表達，激活PI3K/Akt/eNOS信號通路，保護細胞功能，改善動脈粥樣硬化，但關于兩者之間確切的因果關系仍需要進一步的研究進行證實。

綜上所述，高脂飲食可提高實驗ApoE-/-小鼠血脂水平，損傷血管內皮，促進AS的發(fā)展并下調動脈CXCR7、Akt和eNOS的表達；而阿托伐他汀干預后緩解了ApoE-/-小鼠動脈CXCR7、Akt和eNOS蛋白水平下降的趨勢，并改善了AS病變，推測它們之間可能存在相關性。但本研究對于Akt、eNOS與CXCR7之間確切的關系并未明確，需要更進一步的研究對其進行論證。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Expression of CXC chemokine receptor 7 in atherosclerotic ApoE-deficient mice and therapeutic impact by atorvastatinTU Xiao-li, CHEN Qi, ZHANG Hong-zhou, YAN Rui-juan, WU Yan-qing

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wuyanqing01@sina.com.cn)

[ABSTRACT]AIM: To evaluate the expression level of CXC chemokine receptor 7 (CXCR7) in atherosclerotic apolipoprotein E-deficient (ApoE-/-) mice induced by high-fat diet (HFD) and the effects of atorvastatin on it. METHODS: ApoE-/-male mice (8-week-old) were used and were randomly divided into 3 groups following 1-week normal rodent diet: normal diet control (NDC) group , HFD group and HFD+statins (HFD+Sat) group. HE staining and oil red O staining were used to observe the atherosclerotic lesion burdens in the aortas. The expression of CXCR7 on the aortas was detected by Western blot and immunohistochemistry. The expression of Akt and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in the aorta was determined by Western blot.RESULTS: Few lesions were found in the aortas in NDC group. Apparent atherosclerotic plaque burdens were seen in HFD group and HFD+Sat group, while the atherosclerotic plaque burdens in HFD+Sat group were notably reduced compared with HFD group. The protein levels of CXCR7, eNOS and Akt in aorta in HFD group and HFD+Sat group were significantly decreased compared with NDC group, while those in HFD+Sat group were increased compared with HFD group. The protein level of p-eNOS in the aorta and the concentration of NO in the plasma in HFD group were decreased compared with NDC group and HFD+Sat group. CONCLUSION: In ApoE-/-mice, HFD increases the lipid level and promotes the development of atherosclerosis by downregulating the expression of CXCR7, Akt and eNOS. Atorvastatin reverses the above effect of hypercholesterolemia on the expression of CXCR7, Akt and eNOS, thus playing the role in treating atherosclerosis.

[KEY WORDS]Atherosclerosis; Apolipoprotein E; CXC chemokine receptor 7; Atorvastatin

通訊作者△Tel: 023-63693702； E-mail：dy070306@126.com

[收稿日期]2015- 05- 28[修回日期] 2015- 08- 30

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2216- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.016

[中圖分類號]R541.4； R363

[文獻標志碼]A