秦艷華，莊亞東，張　華，韓開冬，石懷彬，尤曉娟，劉獻軍

(江蘇中煙工業(yè)有限責任公司　技術(shù)研發(fā)中心，江蘇　南京　210019)

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定卷煙中的甘草酸

秦艷華，莊亞東，張華，韓開冬，石懷彬，尤曉娟，劉獻軍*

(江蘇中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)研發(fā)中心，江蘇南京210019)

甘草酸是甘草中含有的三萜類物質(zhì)，其鉀、鈣鹽是甘草的主要甜味成分，具有抗炎[1]、抗病毒[2]、抗氧化[3]、促進脂肪代謝[4]等作用，被用作多種保健食品和藥品的原料[5-6]，同時也可用作食品添加劑[7]。甘草用作煙草制品的添加劑已有一百多年歷史，其添加方式以浸膏、甘草粉、酊劑等為主。合理控制甘草成分在卷煙中的用量，可在柔和卷煙煙氣、提調(diào)煙香、掩蓋雜氣以及降低煙氣對鼻腔、口腔及咽喉部粘膜的刺激等方面發(fā)揮重要作用。高純度的甘草酸也可用作煙草添加劑，具有較強的增香效果，同時還有一定的保潤作用[8]。煙葉本身并不含甘草酸，而甘草酸在高強度加工過程中理化性質(zhì)穩(wěn)定(沸點高于1 000℃)，因此其含量的變化情況可以作為評價卷煙制絲工序加料均勻性的重要指標之一。加香加料的均勻性是影響卷煙產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的重要因素，目前國內(nèi)在加香加料均勻性方面開展了一些研究，如以1,2-丙二醇或乙基麥芽酚為標記物，評價施加料液的均勻性[9-11]。但1,2-丙二醇和乙基麥芽酚的沸點低于300 ℃，在制絲工序高強度加工過程中存在較大的損耗。因此，準確測定卷煙中的甘草酸含量，對煙草的品質(zhì)評價和指導(dǎo)準確加料具有重要意義。

甘草酸為甘草的主要成分[12]，其測定方法的研究主要集中在醫(yī)藥、天然產(chǎn)物化學(xué)等領(lǐng)域，包括比色法[13-14]、薄層掃描法[15]、高效毛細管電泳[16]、液相色譜法[17-20]、液相色譜-質(zhì)譜法[21-22]、CdSe量子點熒光增敏法[23]等。田忠等[24]采用高效液相色譜-紫外檢測器測定了白肋煙中的甘草酸含量，但由于卷煙成分復(fù)雜，存在基質(zhì)干擾，方法的選擇性和靈敏度不高，因此難以滿足應(yīng)用甘草酸評價加料均勻性所要求的準確度。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)具有高選擇性、高靈敏度的特點,而應(yīng)用該方法分析卷煙中的甘草酸含量尚未見報道。因此，本文擬應(yīng)用HPLC-MS/MS建立卷煙中甘草酸含量的分析方法，以期為卷煙制絲工序加料均勻性評價提供必要的技術(shù)支持[12,24-25]。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

API 3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司);1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；HY-5回旋振蕩器(常州國華電器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；ME204電子天平(感量0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司)。

甘草酸單銨標準品(純度≥95%，美國Sigma公司)；甲醇(色譜純,德國CNW公司)；醋酸銨(色譜純，美國Sigma公司)；實驗用水為Milli-Q超純水儀制備的超純水。

1.2標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取5.0 mg甘草酸單銨鹽標準品，用甲醇配制成濃度為0.05 mg/mL的標準儲備溶液。

標準工作溶液：準確移取0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL標準儲備液，分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.50 mg/L的甘草酸單銨標準溶液。

1.3樣品前處理

煙絲樣品于40 ℃下烘干2 h，粉碎，過40目篩。稱取約0.250 0 g煙末(精確至0.1 mg)，置于50 mL三角瓶中，加入25.0 mL 甲醇-5 mmol/L醋酸銨(4∶1)萃取液，室溫下以150 r/min振蕩30 min，過濾后待測。

1.4色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。流動相：A為5 mmol/L醋酸銨水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～10.0 min，10%～100%B；10.0～15.0 min，100%B；15.0～15.1 min，100%～10%B；15.1～30.0 min，10%B。流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL。

質(zhì)譜條件：電離模式：電噴霧電離正離子檢測模式(ESI+)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；霧化氣壓力：40 psi；輔助氣壓力：50 psi；氣簾氣壓力：10 psi；碰撞氣壓力：5 psi；離子噴射電壓：5 500 V；離子源溫度：350 ℃；去簇電壓(DP)為55 V；射入電壓(EP)為9 V；碰撞室入口電壓(CEP)為28 V；碰撞室射出電壓(CXP)為10 V；前體離子Q1([M(甘草酸)+H]+)：823m/z；定量、輔助定性產(chǎn)物離子Q3分別為452.8，647.5m/z，對應(yīng)的碰撞能量為45，26 V；標準品保留時間：10.40 min。

2結(jié)果與討論

2.1萃取溶劑的選擇

甘草酸的萃取多采用甲醇-水、乙醇-水作為提取溶劑[17-18,21,24-25]，由于甘草酸在醇中的溶解度大于在水中的溶解度[18]，故以純水為提取劑時甘草酸的提取量偏低。實驗比較了純甲醇、80%甲醇水溶液和50%甲醇水溶液分別作為萃取溶劑時的提取效率，發(fā)現(xiàn)80%甲醇水溶液的萃取效果最好。這是因為醇-水溶液對甘草酸的溶解性較好，對粉狀樣品的穿透性較強，因此提取效率較高，此結(jié)果與文獻報道的結(jié)論相一致[26]。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將甘草酸單銨標準品溶于甲醇，配成濃度為1 μg·mL-1的溶液。通過注射泵連續(xù)進樣，在正離子模式下進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。先進行一級質(zhì)譜圖全掃描，確定其準分子離子[M+H]+，然后對母離子做子離子全掃描，得到碎片離子，選擇豐度較高的兩個特征碎片離子分別作為定性和定量離子。最后對去簇電壓(DP)、射入電壓(EP)、碰撞室入口電壓(CEP)、碰撞能量(CE)、碰撞室射出電壓(CXP)等參數(shù)進行優(yōu)化。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見“1.4”。

2.3色譜條件的優(yōu)化

考察了色譜柱溫度在30～40 ℃區(qū)間內(nèi)對甘草酸分離效果的影響，結(jié)果顯示，當柱溫從30 ℃升至40 ℃時，信噪比從259.5降至237.5，保留時間變短，但分離效果無明顯差別。因此，選擇30 ℃作為色譜柱的分離溫度。

從分析的選擇性及靈敏度的角度考慮，實驗采用甲醇-水體系為流動相，并在流動相中添加醋酸銨，以促進電噴霧離子源條件下化合物的離子化?？疾炝肆鲃酉嘀写姿徜@濃度分別為0,2,5,8 mmol/L時，甘草酸單銨的色譜峰形及其響應(yīng)情況。結(jié)果表明，不加醋酸銨時，色譜峰峰寬較寬。加入2 mmol/L醋酸銨時，可明顯改善色譜峰形且提高離子化效率。醋酸銨濃度增至5 mmol/L時，色譜峰形狀和離子化效率進一步改善，但其濃度繼續(xù)加大時，色譜峰形的變化不明顯，且離子化效率有減小的趨勢(圖1)。因此實驗選擇含5 mmol/L醋酸銨的甲醇-水為流動相體系。

實驗進一步對等度洗脫和梯度洗脫程序進行比較，采用甲醇-5 mmol/L醋酸銨(70∶30)等度洗脫時，甘草酸的保留時間為4.2 min，峰寬1.0 min；采用甲醇-5 mmol/L醋酸銨(50∶50)等度洗脫時，15.0 min內(nèi)不出峰；選用梯度洗脫并優(yōu)化洗脫程序后，甘草酸的保留時間增至10.4 min，峰寬0.4 min。為使化合物有較好的分離和適當?shù)某龇鍟r間，最終選擇梯度洗脫。圖2為甘草酸單銨標準品和卷煙樣品的提取離子色譜圖。

2.4工作曲線、檢出限及定量下限

采用本方法對“1.2”中系列濃度標準工作溶液進行測定，外標法定量，以甘草酸的峰面積(Y)對其濃度(X，mg/L)進行回歸分析，得線性方程為Y=4.82×104X-336，r2=0.999 4。表明甘草酸在0.05～2.50 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；谌恿考皹悠份腿∪芤后w積，以3倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)為1.4 mg/kg，10倍信噪比確定方法的定量下限(LOQ)為4.8 mg/kg。

2.5加標回收率與相對標準偏差

取煙末樣品，分別添加濃度為100 μg·mL-1的標準溶液40，80，120 μL，即加標水平分別為16，32，48 mg·kg-1，按照本方法進行樣品前處理和測定，每個加標水平平行測定6次。日內(nèi)精密度通過1 d內(nèi)測定3個加標水平下的6個平行得到，日間精密度由連續(xù)6 d(每天測定1次)測定3個加標水平下的樣品得到，結(jié)果見表1。由表1可知，方法的加標回收率為89.1%～105.0%，日內(nèi)相對標準偏差(RSD)為0.8%～3.0%，日間RSD為3.8%～5.0%。表明方法具有較好的準確度與精密度。

表1　方法的回收率與相對標準偏差(n=6)

2.6HPLC與LC-MS/MS法的比較

本實驗就方法的靈敏度和選擇性兩個方面對HPLC和LC-MS/MS進行了比較，兩個方法所采用的色譜條件完全一致。由表2可知，LC-MS/MS方法的檢出限、定量下限低于HPLC法，且相同濃度標準溶液(1.0 μg·mL-1)的信噪比是HPLC的300多倍，靈敏度明顯高于HPLC法。由于HPLC法(波長252 nm)的選擇性較差，樣品峰受到雜質(zhì)峰的影響無法實現(xiàn)基線分離，且所測卷煙產(chǎn)品中甘草酸的含量低(低于HPLC定量下限)，因此在同樣前處理條件下不能用該方法進行定量分析。LC-MS/MS方法由于選擇性強，無雜質(zhì)峰干擾，可以達到基線分離。所以，相比于HPLC方法，LC-MS/MS方法更能滿足檢測要求。

表2　HPLC與LC-MS/MS法的比較

2.7實際樣品的測定

采用本文所建立的方法，測定了1種市售卷煙10個批次樣品中甘草酸的含量，其檢出結(jié)果為31.19～34.17 μg/支，RSD為4.5%。該品牌卷煙中甘草酸的含量較為穩(wěn)定，加料均勻性較好。

3結(jié)論

本文建立了檢測卷煙中甘草酸含量的HPLC-MS/MS方法，通過對色譜條件的優(yōu)化，顯著提高了檢測靈敏度；利用串聯(lián)質(zhì)譜高選擇性的特點，有效去除了基質(zhì)成分的干擾，保證了方法的靈敏度。方法檢出限為1.4 mg/kg，加標回收率為89.1%～105.0%，日內(nèi)RSD為0.8%～3.0%，日間RSD為3.8%～5.0%。方法的準確度好，樣品通量較高，適用于卷煙產(chǎn)品中甘草酸含量的分析，尤其適用于卷煙制造過程控制的大規(guī)模樣品檢測。

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摘要：建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定卷煙中甘草酸的分析方法。采用甲醇-5 mmol/L醋酸銨水溶液(4∶1)為萃取溶劑，經(jīng)Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)分離后，串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)檢測，外標法定量。甘草酸在0.05～2.50 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999 4，方法的定量下限為4.8 mg/kg；回收率為89.1%～105.0%，日內(nèi)、日間相對標準偏差(RSD)均不大于5%。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)；卷煙；甘草酸

Determination of Glycyrrhizic Acid in Cigarette by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryQIN Yan-hua,ZHUANG Ya-dong,ZHANG Hua,HAN Kai-dong,SHI Huai-bin,YOU Xiao-juan,LIU Xian-jun*

(Research & Development Center,China Tobacco Jiangsu Industrial Co.,Ltd.,Nanjing210019,China)

Abstract：A new method was developed for the determination of glycyrrhizic acid in cigarette by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The samples were extracted with methnol-5 mmol/L NH4Ac(4∶1) under oscillation,then separated on an Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18column(2.1 mm×150 mm，3.5 μm).The glycyrrhizic acid was detected with HPLC-MS/MS under multiple reaction monitoring(MRM) mode,and quantified by the external standard method.The method had a good linearity(r2>0.999) in the concentration range of 0.05-2.50 mg/L.The recoveries of glycyrrhizic acid were in the range of 89.1%-105.0% with intra-day and inter-day relative standard deviations both not more than 5%.The limit of quantitation(LOQ) of method was 4.8 mg/kg.

Key words：high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);cigarette;glycyrrhizic acid

中圖分類號：O657.63;TS202

文獻標識碼：A

文章編號：1004-4957(2015)12-1398-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.012

通訊作者：*劉獻軍，碩士,工程師，研究方向：煙草化學(xué)分析及卷煙煙氣分析，Tel：025-86478506，E-mail：liuxj@jszygs.com

基金項目：中國煙草總公司增香保潤重大專項“HXD對料液施加效果的影響研究”(110201301027(BR-12)

收稿日期：2015-05-14；修回日期：2015-07-20