許沛冬，鄭肖蘭，趙艷，李秋潔，吳偉懷，賀春萍，習(xí)金根，

梁艷瓊2，鄭金龍2，戚山江1，張曉波4,5*，易克賢2,3*

(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院

熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101；4.熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點實驗室(海南大學(xué))，

海南 海口 570228；5.海南大學(xué)旅游學(xué)院，海南 ?？?570228)

柱花草炭疽菌致病力喪失突變菌株1869的T-DNA插入位點側(cè)翼序列的克隆

許沛冬1,2，鄭肖蘭2，趙艷1，李秋潔2，吳偉懷2，賀春萍2，習(xí)金根2，

梁艷瓊2，鄭金龍2，戚山江1，張曉波4,5*，易克賢2,3*

(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院

熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101；4.熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點實驗室(海南大學(xué))，

海南 海口 570228；5.海南大學(xué)旅游學(xué)院，海南 ?？?570228)

摘要：通過對實驗室已構(gòu)建的柱花草炭疽菌T-DNA突變體庫中各轉(zhuǎn)化子致病力的測定，獲得致病力喪失突變菌株1869。對其進(jìn)行PCR檢測以驗證T-DNA在1869基因組中插入情況，并測定觀察其菌落直徑、菌落形態(tài)及產(chǎn)孢量等生物學(xué)特性，利用TAIL-PCR克隆標(biāo)記基因側(cè)翼序列，采用生物信息學(xué)方法比對基因信息。結(jié)果表明，與柱花草炭疽菌野生型菌株CH008相比，突變菌株1869表現(xiàn)致病力喪失，菌落生長速率也顯著低于野生型；然而，在分生孢子形態(tài)、產(chǎn)孢能力、孢子萌發(fā)率等方面與野生型并無明顯差異。TAIL-PCR擴增得到T-DNA插入位點RB端序列467 bp，LB端側(cè)翼序列388 bp，經(jīng)兩側(cè)序列拼接比對，所得序列與Pac1同源性達(dá)到92%~96%，推測可能由于基因表達(dá)產(chǎn)物調(diào)節(jié)菌株對pH值的敏感性，從而影響了其致病過程。

關(guān)鍵詞：柱花草；炭疽菌；T-DNA；致病力；基因克隆

DOI：10.11686/cyxb2015094http://cyxb.lzu.edu.cn

許沛冬，鄭肖蘭，趙艷，李秋潔，吳偉懷，賀春萍，習(xí)金根，梁艷瓊，鄭金龍，戚山江，張曉波，易克賢. 柱花草炭疽菌致病力喪失突變菌株1869的T-DNA插入位點側(cè)翼序列的克隆. 草業(yè)學(xué)報, 2015, 24(8): 142-149.

Xu P D, Zheng X L, Zhao Y, Li Q J, Wu W H, He C P, Xi J G, Liang Y Q, Zheng J L, Qi S J, Zhang X B, Yi K X. Molecular characterization of the flanking gene of T-DNA insertional, pathogenicity-defectiveColletotrichumgloeosporioidesmutant strain 1869. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 142-149.

收稿日期：2015-02-20；改回日期：2015-03-30

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31072076,31101408),公益性行業(yè)科研專項(201303057)和中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(2015hzs1J002)資助。

作者簡介：許沛冬(1990-)，男，內(nèi)蒙古集寧人，在讀碩士。E-mail：xuridongshengxpd@163.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail：yikexian@126.com, angiaoo@126.com

Molecular characterization of the flanking gene of T-DNA insertional, pathogenicity-defectiveColletotrichumgloeosporioidesmutant strain 1869

XU Pei-Dong1,2, ZHENG Xiao-Lan2, ZHAO Yan1, LI Qiu-Jie2, WU Wei-Huai2, HE Chun-Ping2, XI Jin-Gen2, LIANG Yan-Qiong2, ZHENG Jin-Long2, QI Shan-Jiang1, ZHANG Xiao-Bo4,5*, YI Ke-Xian2,3*

1.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou570228,China; 2.EnvironmentandPlantProtectionInstitute,CATAS,Haikou571101,China; 3.InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,CATAS,Haikou571101,China; 4.KeyLaboratoryofProtectionandDevelopmentUtilizationofTropicalCropGermplasmResources(HainanUniversity),MinistryofEducation,Haikou570228,China; 5.CollegeofTourism,HainanUniversity,Haikou570228,China

Abstract:Colletotrichum gloeosporioides is a fungal pathogen of Stylosanthes guianensis causing anthracnose disease. Pathogenicity defective mutant strains of C. gloeosporioides were screened in the laboratory and strain 1869 selected for study. The mutant strain was compared with wild type strain CH008 for phenotypic characteristics, including colony diameter, colony morphology, sporulation ability and spore germination rate. Colony diameter of CH008 and strain 1869 differed, but the other traits did not. DNA of the mutant strain was extracted, and using thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) a T-DNA insertion mutation site believed responsible for loss of pathogenicity was identified. The RB and LB flanking sequences at the insertion site were cloned, also using TAIL-PCR. The RB flanking sequence was 467 bp in length, while the LB flanking sequence was 388 bp. The BLAST result showed that the sequence had 92%-96% homology to gene Pac1. By predicting the function of a protein coded by the flanking sequence,we inferred that the gene in question regulated the sensitivity to pH, and in this way affected the pathogenic potential of C. gloeosporioides.

Key words:Stylosanthes guianensias; Colletotrichum gloeosporioides; T-DNA; pathogenicity; gene clone

柱花草(Stylosanthesguianensis)是廣泛種植于熱帶、亞熱帶地區(qū)的優(yōu)質(zhì)豆科牧草，在我國有“北有苜蓿(Medicago)，南有柱花草”的美譽，被稱為“熱帶牧草之王”[1-2]。柱花草炭疽病是影響柱花草產(chǎn)量的重要病害，其主要由病原真菌膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起，病原菌可侵染柱花草葉片、葉柄、莖稈乃至花序等各個部位，且存在高度的遺傳變異性及生物多樣性[3-4]。炭疽菌危害的植物種類繁多，包括各類木本、草本植物，直到近年來，仍有炭疽菌感染新的植物的報道，如當(dāng)歸(Angelicasinensis)[5]等。對于炭疽病的防治而言，在化學(xué)防治及抗病品種的選育遭遇巨大的瓶頸后，眾多的學(xué)者將目光投向于對病原菌致病相關(guān)基因的分離與研究，以期望了解病原菌的侵染及致病機制，而根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacteriumtumefaciensmediated transformation， ATMT)的T-DNA 插入突變技術(shù)即成為了研究致病相關(guān)基因的有效手段[6-8]。自1995年，Bundock 等[9]首次利用根癌農(nóng)桿菌成功介導(dǎo)酵母菌遺傳轉(zhuǎn)化以來，ATMT法已經(jīng)在構(gòu)建真菌的突變體庫中取得了巨大的進(jìn)展。在炭疽菌方面，有關(guān)專家學(xué)者先后對黃瓜(Cucumissativus)[10]、香蕉(Musanana)[11]、芒果(Mangiferaindica)[12]等遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行研究，本實驗室胡彩平等[13]對柱花草炭疽菌進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。利用ATMT，國內(nèi)外學(xué)者紛紛篩選得到了部分炭疽菌致病相關(guān)基因，如Stephenson等[14]獲得了CgDN3基因，該基因在侵染寄主的活體營養(yǎng)階段表達(dá)；Thon等[15]獲得了CPR1基因，其為編碼信號肽基因。但柱花草炭疽菌的致病相關(guān)基因尚未有報道。

本試驗對篩選得到的柱花草炭疽菌致病力喪失菌株1869進(jìn)行了生物學(xué)性狀的分析，用分子生物學(xué)手段分析1869菌株T-DNA的序列插入位點，通過TAIL-PCR技術(shù)克隆側(cè)翼序列，對該序列在炭疽病菌致病過程的作用進(jìn)行分析，希望能夠為柱花草炭疽病致病相關(guān)基因的克隆和研究提供一定的理論基礎(chǔ)，為柱花草炭疽病的致病機理以及防治策略提供一定的分子參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌株參試菌株包括野生型菌株CH008以及突變菌株1869。其中CH008為實驗室分離獲得的強致病力炭疽菌株[16]，突變菌株1869則是由柱花草炭疽菌野生型菌株CH008通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化(ATMT)的T-DNA 插入獲得的致病力喪失突變體。所用根癌農(nóng)桿菌菌株為AGL-1，該菌內(nèi)含pSULF.gfp質(zhì)粒，以pCAMBIAl300為骨架，含有氯嘧磺隆抗性標(biāo)記基因ILV1以及報告基因GFP的二元載體[17]。菌株均保存于實驗室-70℃冰箱。

1.1.2培養(yǎng)基及主要儀器Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl 8.0 g，Agar 20 g，補充ddH2O至1000 mL，pH值7.0。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 15~20 g，瓊脂 15~20 g，補充ddH2O至1000 mL。其對應(yīng)液體培養(yǎng)基則不加瓊脂。

主要儀器：HZO-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱，Eppendorf 5333型梯度PCR儀，LDZX-75KB高壓蒸汽滅菌鍋，OLYMPUS U-RFL-T型熒光數(shù)碼生物顯微鏡，721型分光光度計，便攜式CP-401型pH計。

1.1.3引物與主要試劑試驗所用引物名稱及序列見表1。引物合成由上海英濰捷基及英駿生物技術(shù)公司完成，測序工作由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。DNA Maker、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司。Fungle gDNA Kit 購于Biomiga公司；Plasmid Mini Kit I購于Omega公司；pEASY-T1 Cloning vector、E.colitrans T1，購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.4試驗時間2014年8月至12月于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所完成全部試驗內(nèi)容。

1.2　試驗方法

1.2.1突變菌株致病力分析突變體菌株致病力測定采用菌餅反接離體葉片法。柱花草選用炭疽病易感病品種格拉姆，于2014年8月，柱花草生長旺盛時期選取葉齡7 d左右的柱花草三出復(fù)葉，針刺葉片，將菌餅接種在葉片上(菌絲面緊貼傷口)，設(shè)置2個對照，野生型CH008及空白PDA培養(yǎng)基餅塊。將葉片放置在培養(yǎng)盤中，設(shè)3個重復(fù)，盤內(nèi)進(jìn)行保濕處理，保鮮膜封口，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察葉片發(fā)病情況。

1.2.2T-DNA插入穩(wěn)定性PCR檢測2014年8月，將菌株于PDA培養(yǎng)基上活化，28℃恒溫培養(yǎng)6 d，收集孢子及菌絲，于PDA液體培養(yǎng)基中，28℃ 180r/min振蕩培養(yǎng)4 d，滅菌紗布過濾收集菌絲，冷凍干燥過夜。使用Fungle gDNA Kit提取DNA，方法參照說明書進(jìn)行。根據(jù)T-DNA含有氯嘧磺隆抗性標(biāo)記基因ILV1以及報告基因GFP的二元載體設(shè)計引物GFP1、GFP2(表1)。以GFP1、GFP2為引物，CH008、1869的DNA為模板進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系為2.0 μL 10×Buffer，1.2 μL dNTPs，引物(20 μmol/μL)各0.5 μL，0.2 μL Taq酶，1 μL DNA模板，滅菌去離子水補齊體系20 μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性4 min； 94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s， 35次循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

注： W=A或T，S=G 或 C，N=A、T、G或C。

Note: W=A or T；S=G or C；N=A,T,G or C.

1.2.3突變菌株生物學(xué)性狀分析挑取保存的野生型菌株CH008及突變菌株1869于PDA培養(yǎng)基上劃線活化，28℃恒溫培養(yǎng)6 d。在菌落邊緣用打孔器打取菌餅(直徑為0.5 cm)，用以完成突變體生物學(xué)性狀的分析測定。所有試驗于2014年9月完成，以下每個處理設(shè)置3個重復(fù)，所得數(shù)據(jù)用Excel整理，采用DPS(7.05)統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，用Tukey法進(jìn)行多重比較。

1) 菌落形態(tài)的觀察及生長速率的測定。將上述菌餅接種于直徑為9 cm培養(yǎng)皿的PDA平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)6 d后測量菌落直徑并觀察菌落形態(tài)。

2) 孢子形態(tài)的觀察及產(chǎn)孢能力的測定。取5塊菌餅接種至150 mL的PDA液體培養(yǎng)基中，在28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，用滅菌紗布過濾獲得孢子懸浮液。用血球計數(shù)板計算產(chǎn)孢量并觀察孢子形態(tài)及大小。

3) 孢子萌發(fā)的測定。調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為1.0×105個/mL，取30 μL滴于干凈的載玻片上，將載玻片放置在吸水飽和的濾紙上做保濕處理，6~8 h 后觀察孢子萌發(fā)，24 h觀察附著胞的形成。

1.2.4突變菌株側(cè)翼序列的克隆利用交錯式熱不對稱PCR方法(thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)克隆1869插入位點的側(cè)翼序列。隨機引物、特異性嵌套引物設(shè)計參考Mullins等[18]、Combier等[19]的相關(guān)方法，詳見表1。其中隨機引物包括AD1、AD2、AD3、AD4、AD8、AD9；特異性嵌套引物RB1/RB2/RB3擴增插入T-DNA片段RB端側(cè)翼序列，LB1/LB2/LB3擴增插入T-DNA片段LB端側(cè)翼序列。TAIL-PCR共包含3輪反應(yīng)，第1輪反應(yīng)以DNA為模板進(jìn)行，用量1 μL；第2輪及第3輪反應(yīng)以前一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍為模板，用量2 μL，反應(yīng)體系及程序參考Mullins等[18]的方法進(jìn)行。

1.2.5擴增產(chǎn)物的克隆及目的片段的測序與分析利用pEASY-T1 Cloning Kit對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，按照說明書將PCR產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體上，加連接產(chǎn)物于感受態(tài)細(xì)胞中。在含有IPTG 和X-gal 的LB(Amp+)平板上，根據(jù)藍(lán)白斑篩選方法挑取白色菌落。利用PCR方法檢測陽性克隆。使用Plasmid Mini Kit I對克隆產(chǎn)物提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，分析T-DNA插入位點側(cè)翼序列，采用NCBI網(wǎng)站BLAST程序完成序列相似性的比對和分析。

2結(jié)果與分析

2.1　突變菌株的致病力分析

將突變菌株1869、野生型菌株CH008菌餅以及空白PDA培養(yǎng)基餅塊反接離體葉片。28℃恒溫培養(yǎng)5 d。結(jié)果顯示(圖1)，野生型菌株CH008反接的離體柱花草葉片有明顯褐色病斑，且病斑范圍從葉片延伸到葉柄；突變菌株1869及空白PDA培養(yǎng)基反接的離體柱花草葉片無病斑產(chǎn)生。重復(fù)試驗，且多代培養(yǎng)突變菌株1869進(jìn)行試驗，結(jié)果相同。即突變菌株1869致病力喪失。

2.2　T-DNA插入穩(wěn)定性PCR檢測

提取突變菌株1869、野生型菌株CH008的基因組DNA，以GFP1、GFP2為引物，進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示(圖2)，以突變菌株1869的DNA為模板，擴增得到約750 bp的T-DNA特異條帶；以野生型菌株CH008的基因組DNA為模板未得到條帶。即說明T-DNA穩(wěn)定插入到1869的基因組中。

圖2　突變菌株1869的分子檢測Fig.2　The molecular detection of mutant strain 1869

2.3　突變菌株生物學(xué)性狀分析

測定觀察突變菌株1869的菌落直徑、菌落形態(tài)及產(chǎn)孢量等生物學(xué)特性，以野生型CH008為對照，并利用數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計軟件進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果表明，與野生型CH008菌株相比，突變菌株1869生長速率及菌落直徑存在顯著性差異(圖3A、表2)，CH008菌絲生長稠密，生長速率較快，在PDA平板培養(yǎng)6 d，菌落直徑可達(dá)(7.18±0.11) cm，且可以觀察到菌絲下有大量分生孢子產(chǎn)生；突變菌株1869在菌落形態(tài)上無明顯差異，但生長速率較慢，培養(yǎng)6 d，菌落直徑為(5.53±0.18)cm，也可觀察到分生孢子產(chǎn)生。

將突變菌株1869和野生型菌株CH008接種至PDA液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，以獲得孢子懸浮液。用血球計數(shù)板計算產(chǎn)孢量并觀察孢子形態(tài)及大小。結(jié)果表明，1869與CH008的孢子形態(tài)均表現(xiàn)為長柱形或短棒形，無顯著性差異；在產(chǎn)孢量方面，無顯著性差異(圖3B、表2)，PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，均有分生孢子產(chǎn)生，CH008產(chǎn)孢量為(6.13±2.52)×106個/mL，1869產(chǎn)孢量為(3.43±0.85)×106個/mL。由此推測，T-DNA插入突變菌株1869的位點并不能導(dǎo)致分生孢子的變化，無論野生型菌株還是突變體菌株均表現(xiàn)為產(chǎn)生大量分生孢子，以有利于病原菌對寄主的迅速侵染、致病。

在對1869與CH008的孢子懸浮液進(jìn)行孢子萌發(fā)的觀察發(fā)現(xiàn)(圖3C、表2)，8 h后CH008孢子萌發(fā)率為(89.79±1.40)%，1869的孢子萌發(fā)率為(93.30±0.68)%，二者無顯著性差異，24 h觀察附著胞的形成，1869與CH008均未產(chǎn)生附著胞。即T-DNA插入突變菌株1869的位點并不是通過影響孢子萌發(fā)來導(dǎo)致致病力的喪失。

圖3　致病力喪失突變體菌株1869的生物學(xué)性狀 Fig.3　The phenotypes of pathogenicity-defective mutant strain 1869　A:菌株在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)Phenotypic analysis diameters on PDA medium；B：菌株的產(chǎn)孢量Statistical analysis of conidia production；C：菌株的孢子萌發(fā)情況Spore germination of pathogenic mutants.左：野生型菌株CH008；右：突變體菌株1869。 Left: mutant strain 1869；Right: wild type strain CH008.

2.4　突變菌株側(cè)翼序列的克隆

利用TAIL-PCR方法克隆1869插入位點的側(cè)翼序列。通過對隨機引物的篩選，得知擴增1869 T-DNA插入位點的有效隨機引物左翼和右翼均為AD9，以隨機引物AD9、特異性嵌套引物RB1/RB2/RB3擴增插入T-DNA片段RB端側(cè)翼序列，得到長度約500 bp的特異序列(圖4)；以隨機引物AD9、特異性嵌套引物L(fēng)B1/LB2/LB3擴增插入T-DNA片段LB端側(cè)翼序列，得到長度約400 bp的特異序列(圖4)。

圖4　突變菌株1869 TAIL-PCR擴增結(jié)果Fig.4　The TAIL-PCR amplification results of mutant strain 1869　　　M：Maker；L-2/ R-2:第2輪左翼/右翼序列The LB or RB flanking sequence of No.2；L-3/R-3：第3輪左翼/右翼序列The LB or RB flanking sequence of No.3.

2.5　擴增產(chǎn)物的克隆及目的片段的測序與分析

對TAIL-PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行克隆，在含有IPTG和X-gal 的LB(Amp+)平板上，根據(jù)藍(lán)白斑篩選方法挑取白色菌落，經(jīng)PCR方法檢測，所得菌落為陽性克隆。對克隆產(chǎn)物提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果顯示，克隆得到RB端側(cè)翼序列467 bp， LB端側(cè)翼序列388 bp。對序列進(jìn)行拼接(圖5)，采用NCBI網(wǎng)站BLAST程序完成序列相似性的比對，結(jié)果顯示，所得序列與炭疽菌環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因Pac1同源性達(dá)到92%~96%。

表2　菌株1869與CH008的生物學(xué)性狀差異顯著性

注：小寫字母表示菌株在0.05水平上的差異顯著性；大寫字母表示菌株在0.01水平上的差異顯著性。

Note: Small letters represent the statistic difference at 0.05 level; capital letters indicate the statistic difference at 0.01 level.

圖5　突變菌株1869 T-DNA插入位點側(cè)翼序列的克隆與分析Fig.5　The molecular clone and analysis of the T-DNA flanking sequences of mutant strain 1869

3結(jié)論與討論

真菌對植物的侵染方式各不相同，而對于炭疽菌屬真菌侵染初期主要為分生孢子附著在寄主的表面，以及分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管，而后分化成為形態(tài)各異的附著胞[20]；當(dāng)其穿透寄主表皮后，則主要包括細(xì)胞內(nèi)半活體營養(yǎng)型、角質(zhì)層內(nèi)死體營養(yǎng)型[21]。也就說明，生物學(xué)性狀方面的變異，可能直接導(dǎo)致炭疽菌對于寄主的侵染[22]；另一方面，致病力喪失突變體的致病力變化也可能導(dǎo)致某些生物學(xué)特性的差異。在本研究中，與野生型菌株CH008相比，突變菌株1869表現(xiàn)致病力喪失，其菌落在生長速率及菌落直徑上具有顯著性差異；在形態(tài)、產(chǎn)孢能力、孢子萌發(fā)與野生型無明顯差異。由此說明，突變菌株1869 T-DNA插入位點可能引起了菌株生長速率的變化，但未插入影響其產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、附著胞產(chǎn)生的關(guān)鍵基因中。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法(ATMT)獲得突變體菌株，以鑒定突變菌株的變異情況，分析其基因變化，目前在國內(nèi)外都取得了極大的進(jìn)展，通過T-DNA插入位點標(biāo)記基因的分析，各國學(xué)者已經(jīng)成功獲得了炭疽菌致病相關(guān)基因CgDN3[14]、CPR1[15]、CPR1[23]、PKSI[24]等，但尚未在柱花草炭疽菌中獲得任何相關(guān)基因。本研究利用ATMT法獲得的突變體菌株1869通過PCR檢測，可知T-DNA穩(wěn)定插入到1869相關(guān)基因中。TAIL-PCR方法被廣泛應(yīng)用于未知側(cè)翼序列的擴增與克隆，而利用最適的隨機引物是擴增成功的關(guān)鍵[25]。在本研究中，擴增1869 T-DNA插入位點的有效隨機引物左翼和右翼均為AD9，并且成功克隆得到RB端側(cè)翼序列467 bp， LB端側(cè)翼序列388 bp。

在本研究中，對克隆得到的側(cè)翼序列進(jìn)行拼接，采用NCBI網(wǎng)站BLAST程序完成序列相似性的比對，結(jié)果顯示，所得序列與炭疽菌環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因Pac1同源性達(dá)到92%~96%。Pac1基因最早由Miyara等[26]在鱷梨膠孢炭疽菌中發(fā)現(xiàn)，并且經(jīng)研究，敲除Pac1基因可下調(diào)pelB基因，而pelB基因表達(dá)裂解酶直接影響到菌株的毒力作用；此外Pac1基因可編碼pacC轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)菌株對pH的敏感性。有關(guān)學(xué)者[27-28]曾對pH值對柱花草炭疽菌的生長影響進(jìn)行測定，研究發(fā)現(xiàn)柱花草炭疽菌可生長的pH值為3.0~14.0，最適生長pH值為6.4~7.2，在一定的范圍內(nèi)，隨pH值的升高，炭疽菌產(chǎn)孢量減少，但菌絲生長量增加。說明pH值確定對柱花草炭疽菌的生長具有一定的影響，且可以通過對Pac1基因的研究達(dá)到炭疽菌致病力減弱或喪失的效果。后續(xù)，將深入展開柱花草炭疽菌中Pac1基因的研究，分析其基因功能，為柱花草炭疽病的防治，奠定一定的分子理論依據(jù)。

References：

[1]Liu F M, Cui X D, Wu K R,etal. Biological characteristics ofColletotrichumgloeosporioidesPenz. causing anthracnose ofStylosanthesguianensis. Guangdong Agricultural Science, 2012, 16: 65-68.

[2]Yi K X. Development and prospects and countermeasures on tropical forage industrial production in China. Chinese Journal of Tropical Agriculture, 2001, 4: 30-34.

[3]Jiang C S, Zhou D M, Zhang Z Y. Stylo anthracnose and the progress of its breeding for resistance to disease. Journal of Sichuan Grassland, 2002, (1): 22-27.

[4]Chakraborty S, Perrott R, Charchar M J D,etal. Biodiversity, epidemiology and virulence ofColletotrichumgloeosporioides.Ⅱ.Genetic and pathogenic diversity in isolates ofColletotrichumgloeosporioidesfrom eight species of stylosanthes.Tropical Grasslands, 1997, 31: 393-401.

[5]Bian J, Chen T X, Chen X R. Pathogen identification and occurrence regularity of a novel disease——Angelicaanthracnose.Acta Prataculture Sinica, 2014, 23(6): 266-273.

[6]Chen X L, Yang J, Peng Y L. Large-scale insertional mutagenesis inMagnaportheoryzaebyAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation. Methods in Molecular Biology, 2011, 722: 213-224.

[7]Liu P J, Wang Z Y, Wang Q H,etal.Agrobacteriumtumefaciensmediated transformation ofMagnaporthegriseaand identification of pathogenicity defective mutant. Chinese Journal of Rice Science, 2006, 20(3): 231-237.

[8]Yu M N, Hu J K, Huang L,etal. Molecular characterization of T-DNA integration of theUstilaginoideavirensMutant 5062. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(9): 1790-1798.

[9]Bundock Paul, Dulk-Ras Amkeden, Beijersbergen Alice G M,etal. Trans-kingdom T-DNA transfer fromAgrobacteriumtumefaciensto saccharomyces cerevisiae. The EMBO Journal, 1995, 14(3): 3206-3214.

[10]Fang L, Liu H Q, Song F M,etal.Agrobacteriumtumefaciensmediated transformation ofColletotrichumlagenariumthe causal agent of cucumber anthracnose. Journal of Zhejiang University(Agriculture and Life Sciences), 2006, 32(4): 360-366.

[11]Zhen D X, Li M H, Jiang Z D.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation ofColletotrichummusae. Journal of Zhongkai Agrotechnical College, 2005, 18(4): 42-44.

[12]Li W, Zheng X L, He C P,etal. Establishment ofAgrobacterium-mediated transformation systems forColletotrichumgloeosporioides. Plant Protection, 2008, 34(1):76-81.

[13]Hu C P, Zheng J L, Gao J M,etal. Optimization of genetic transformation system of StyloAnthracnosemediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.Chinese Journal of Tropical Crops, 2013, 34(6): 1007-1012.

[14]Stephenson S A, Hatfield J, Rusu A G,etal.CgDN3: An essential pathogenieity gene ofColletotrichumgloeosporioidesnecessary to avert a hypersensitive-like response in the hostStylosanthesguianensis. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2000, 13: 929-941.

[15]Thon M R, Nuekles E M, Takaeh J E,etal. CPR1: A gene encoding a putative signal peptidase that functions in pathogenicity ofColletotrichumgraminicolato maize. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2002, 15: 120-128.

[16]Yi K X, Huang J S, Liu G D. Genetic diversity analysis of Chinese Stylo anthracnose pathogens using random amplified polymorphic DNA.Acta Microbiologica Sinica, 2003, 43(3): 379-387.

[17]Gao J M, Hu C P, Zheng J L,etal. Construction and analysis of a T-DNA insertional mutant library forColletotrichumgloeosporioides. Guangdong Agricultural Science, 2014, 19(10): 142-145.

[18]Mullins E D, Chen P X, Romaine P,etal.Agrobacterium-mediated transformation ofFusariumoxysporum: An efficient tool for inserlional mutagenesis and gene transfer. Phytopathology, 2001, 91: 173-180.

[19]Combier J P, Melayah D, Raffier C,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation as a tool for insertional mutagenesis in the symbiotic ectomycorrhizal fungus Hebeloma Cylindrosporum.FEMS Microbiology Letters, 2003, 220(1): 141-148.

[20]Liu M, Zhang W, Zhou Y,etal. Research progress on grape anthracnose. China Plant Protection, 2014, 34(1): 29-33.

[21]Wharton P S, Julian A M. A cytological study of compatible and incompatible interactions betweenSorghumbicolorandColletotrichumsublineolum. New Phytologist, 1996, 134(1): 25-34.

[22]Kim Y K, Wang Y H, Liu Z M,etal. Identification of a hard surface contact-induced gene inColletotrichumgloeosporioidesconidia as a sterol glycosyl transferase, a novel fungal virulence factor. The Plant Journal, 2002, 30: 177-187.

[23]Thon M R, Nuckles E M, Takach J E,etal. CPRl: A gene encoding a putative signal peptidase that functions in pathogenicity ofColletotrichumgraminicolato maize. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2002, 15: 120-128.

[24]Tsuji G, Fujii S, Tsuge S,etal. TheColletotrichumlagenariumSte12-Like gene CSTl is essential for appressorium penetration. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2003, 16: 315-325.

[25]Sun B Y, Piao H L, Park S H,etal. Selection of optimal primers for TAIL-PCR in identifying Ds flanking sequences from Ac/Ds insertion rice lines. Chinese Journal of Biotechnology, 2004, 20(6): 821-826.

[26]Miyara I, Shafran H, Haimovich H K,etal. Multi-factor regulation of pectate lyase secretion byColletotrichumgloeosporioidespathogenic on avocado fruits. Molecular Plant Pathology, 2008, 9(3): 281-291.

[27]Zhang C C, Liang Y C, Meng J R,etal. Identification and biological character research on anthracnose ofStylosanthesspp. Journal of Guangxi Agricultural University, 1998, 17(1): 87-91.

[28]Feng S F, Li F E, He C Z,etal. Bionomics and epidemiology of anthracnose onStylosanthesspp. Chinese Journal of Tropical Crops, 1994, 15(1): 90-93.

參考文獻(xiàn)：

[1]劉鳳民, 崔曉東, 伍康榮, 等. 柱花草炭疽菌生物學(xué)特性的研究. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 16: 65-68.

[2]易克賢. 我國熱帶牧草產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展現(xiàn)狀、前景與對策. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2001, 4: 30-34.

[3]蔣昌順, 鄒冬梅, 張正義. 柱花草炭疽病及其抗病育種研究進(jìn)展. 四川草原, 2002, (1): 22-27.

[5]卞靜, 陳泰祥, 陳秀蓉. 當(dāng)歸新病害——炭疽病病原鑒定及發(fā)病規(guī)律研究. 草業(yè)學(xué)報, 2014, 23(6): 266-273.

[7]劉朋娟, 王政逸, 王秋華, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化及致病缺陷突變體篩選. 中國水稻科學(xué), 2006, 20(3): 231-237.

[8]俞咪娜, 胡建坤, 黃磊, 等. 稻曲病菌T-DNA插入突變體5062的插入位點分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(9): 1790-1798.

[10]方麗, 劉海青, 宋鳳鳴, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化. 浙江大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2006, 32(4): 360-366.

[11]曾大興, 李敏慧, 姜子德. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的香蕉炭疽菌轉(zhuǎn)化. 仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報, 2005, 18(4): 42-44.

[12]李偉, 鄭肖蘭, 賀春萍, 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的膠孢炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立. 植物保護(hù), 2008, 34(1): 76-81.

[13]胡彩平, 鄭金龍, 高建明, 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)柱花草炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化. 熱帶作物學(xué)報, 2013, 34(6): 1007-1012.

[16]易克賢, 黃俊生, 劉國道. 中國柱花草炭疽病原菌遺傳多態(tài)性的RAPD分析. 微生物學(xué)報, 2003, 43(3): 379-387.

[17]高建明, 胡彩平, 鄭金龍, 等. 柱花草炭疽病菌T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建與分析. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 19(10): 142-145.

[20]劉梅, 張瑋, 周瑩, 等. 葡萄炭疽病研究進(jìn)展. 中國植保導(dǎo)刊, 2014, 34(1): 29-33.

[27]張超沖, 梁英彩, 蒙絞榮, 等. 柱花草炭疽病菌的鑒定及生物學(xué)特性研究. 廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1998, 17(1): 87-91.

[28]馮淑芬, 李鳳娥, 何朝族, 等. 筆花豆炭疽病菌生物學(xué)特性和流行條件研究. 熱帶作物學(xué)報, 1994, 15(1): 90-93.