宮 強，孟 影，馬文秀，延立勇，曹 雪，戢 爽　(延邊大學農學院，吉林延吉 133000)

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延邊黃牛和延黃牛脂肪組織FASN基因mRNA表達水平與肉質的關系

宮 強，孟 影，馬文秀，延立勇，曹 雪，戢 爽*(延邊大學農學院，吉林延吉 133000)

延邊黃牛是吉林延邊地區(qū)役肉兼用黃牛品種，是國家級資源保護品種，是我國五大地方良種牛之一。延黃牛2006年在延邊區(qū)培育而成，含75%延邊黃牛血統(tǒng)和25%利木贊牛血統(tǒng)，采用了雜交—回交—自群繁育、群體繼代選育幾個階段。延黃牛是繼夏南牛之后由農業(yè)部于2008年初宣布培育成功的我國第2個肉用型牛品種。

脂肪酸合成酶(FASN)是影響人和動物脂肪沉積的關鍵酶，主要由脂肪細胞分泌，牛的FASN基因位于BTA19，已有報道BTA19上有與脂肪相關的QTL[1]，F(xiàn)ASN基因全長18 693 bp，由43個外顯子組成，轉錄形成8 225 bp的mRNA，編 碼2 513個氨基酸[2]。研究表明，F(xiàn)ASN基因的表達量與IMF的含量相關[3]。FASN是一種復雜的同型二聚體酶，在酰基輔酶A和多聚酰輔酶A合成長鏈脂肪酸的過程中起重要作用[4-5]。動物體內脂肪酸合成酶的數(shù)量和活性對動物脂肪酸的合成及體脂的沉積具有重要意義。深入研究發(fā)現(xiàn)FASN基因的SNP位點與反芻動物肌肉中脂肪酸組成有很強的相關性[6-8]。因此，可以通過調控FASN基因在動物體內的表達有效控制脂肪酸的沉積，改善動物品質。筆者以延邊黃牛和延黃牛為研究對象，采用熒光定量PCR的方法檢測不同品種牛不同脂肪沉積部位的FASN 基因mRNA表達水平，探討FASN在脂肪沉積過程中的作用，旨在為不同部位脂肪沉積的分子機理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物試驗動物為24月齡延邊黃牛和延黃牛各9頭，來自龍井犇福牛業(yè)，屠宰后分別取其皮下脂肪、腹部脂肪、腎周脂肪、背最長肌、心臟、肝臟、肺臟、腎臟和小腸共9個組織和器官，迅速投入液氮，然后轉入-80 ℃超低溫冰箱中凍存。

1.2主要試劑TRIzol，購自Invitrogen公司；RNeasy Lipid Tissue Mini and Midi Kits，購自Qiagen公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with a gDNA Remover kit，購自Toyobo公司；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix，購自Toyobo公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC等購自Sigma公司。

1.3引物設計與合成根據(jù)GenBank收錄的?；騀ASN mRNA(NM_001012669)和GAPDH mRNA(NM_001034034)序列，利用Primer 5.0和Oligo 7軟件按照引物設計的基本要求設計FASN基因定量PCR引物及內參引物，F(xiàn)ASN(5′-3′) Sense: CTGGAGCGTGAGCACAACCTG，Anti-sense: GTGTGGAGTCCGTCAGCTCAT；GAPDH(5′-3′)，Sense: CGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTG，Anti-sense:CAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCT(引物由上海生物工程有限公司合成)。

1.4方法

1.4.1脂肪及其他組織總RNA提取。以成年延邊黃牛和延黃牛脂肪組織及其他器官組織為材料，使用Trizol試劑盒提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并檢測RNA的濃度，-80 ℃下保存待用。

1.4.2總RNA的反轉錄。按照日本東洋紡ReverTra Ace PCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒的要求進行，將總RNA量統(tǒng)一調整到500 ng進行反轉錄，為了保證定量結果的準確性，在反轉錄體系中增加了去DNA的操作步驟,體系為RNA template 2 μl，4×DN Master Mix 2 μl， Nuclease-free Water 4 μl輕輕攪拌混勻后，在37 ℃條件下溫育5 min，將上述反應液置于冰上加入2 μl的5×RT Master MixⅡ逆轉錄酶，37 ℃條件下溫育15 min，在50 ℃條件下溫育5 min，在98 ℃條件下酶失活，以上述反應液為模板進行Real-time PCR。

1.4.3Real-time定量PCR。利用實時熒光定量儀檢測mRNA表達水平，熒光定量PCR反應體系：cDNA模板1 μl、SYBR qPCR Mix 12.5 μl、上下游引物各1 μl、超純水9.5 μl,充分混勻。熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，每個樣品3個重復，并生成溶解曲線。

1.4.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。試驗結果采用相對比較Ct法，即通過計算2-ΔΔCt值計算相對表達量，以GAPDH為參比基因進行標準化，計算每組數(shù)據(jù)的平均值和標準誤。為了保證試驗結果的準確性，每組試驗重復3次，重復3次。應用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，結果通過GraphPad軟件作圖。

2結果與分析

2.1總RNA提取結果從延邊黃牛和延黃牛各組織器官中提取總RNA，結果如圖1所示。電泳檢測結果表明，總RNA的完整性較好，基本沒有降解，微型紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，無DNA或蛋白污染，可滿足后續(xù)試驗要求。

2.2FASN基因mRNA的PCR擴增將擴增所得不同品種牛FASN基因和GAPDH基因的PCR產物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)擴增大小與設計引物片段相符(圖2)。

2.3FASN基因mRNA在延邊黃牛不同組織和器官中表達水平分析從圖3可以看出，F(xiàn)ASN基因 mRNA在延邊黃牛的不同組織和器官中均有表達，F(xiàn)ASN基因在不同脂肪組織中表達量均高于背最長肌。內臟組織中，F(xiàn)ASN基因在肺中的表達量高于其他器官，在小腸、心臟、肝臟和腎臟中微弱表達，表達差異不顯著。

2.4FASN基因mRNA在延黃牛不同組織和器官中表達水平分析從圖4可以看出，F(xiàn)ASN mRNA在延黃牛的不同組織和器官中均有表達，F(xiàn)ASN mRNA在皮下脂肪和腹部脂肪表達量均顯著高于腎周脂肪和背最長肌。FASN基因在肺中的表達量高于其他器官，在小腸、心臟、肝臟和腎臟中表達量微弱，而在腹部脂肪組織中表達量顯著高于肺臟、心臟、肝臟、腎臟和小腸。

2.5FASN基因mRNA在延邊黃牛和延黃牛相同組織器官中表達水平分析從圖5可以看出，F(xiàn)ASN基因mRNA在延黃牛的皮下脂肪和腹部脂肪中表達量都高于延邊黃牛。肺中FASN的表達量高于其他臟器，在小腸、心臟、肝臟和腎臟中表達量微弱，而其在延黃牛的皮下脂肪和腹部脂肪中的表達量均顯著高于肺臟、肝臟、腎臟和小腸。

3討論

3.1FASN基因在脂類代謝中作用脂肪組織是能量貯存和釋放的主要組織，能夠調節(jié)機體能量平衡。一直以來，脂肪組織被認為是不活躍的組織，而越來越多的研究表明脂肪組織可通過內分泌、旁分泌的形式分泌重要代謝因子，這些因子通過自分泌或者旁分泌途徑調節(jié)脂肪細胞自身代謝，而通過內分泌的方式調節(jié)其他組織的代謝。FASN是一種多功能酶，對脂類的生成起著重要作用，從而調節(jié)脂肪組織蓄積和發(fā)育[9]。不同基因型FASN與印第安人體脂蓄積比例顯著相關，腹脂中FASN表達量較高[10]。這表明FASN基因是對脂肪儲存和代謝過程起重要作用的候選基因。脂肪組織作為一個主要的內分泌器官，可以分泌大量的因子調節(jié)遠處的靶組織[11]。該研究結果表明FASN在脂肪組織中表達量較高，而在其他組織中表達量低，F(xiàn)ASN是脂肪酸合成過程的關鍵酶，脂肪組織可能通過內分泌作用，間接調控其他器官。

3.2脂肪不同沉積部位的氨基酸組成研究目前，關于在不同脂肪組織中與脂代謝相關基因的報道較少。日本和牛FASN基因的SNP研究結果表明不同F(xiàn)ASN基因型與肉質相關，從而影響氨基酸的組成[12]。對烏龜?shù)南嚓P研究表明不同部位的脂肪組織氨基酸的組成存在差異[13]。體腔內脂肪組織和腎臟脂肪組織由較高的飽和脂肪酸構成，而皮下脂肪組織由較高的不飽和脂肪酸構成。對延黃牛的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN基因在皮下脂肪和腹部脂肪中的表達量顯著高于腎周脂肪，這些差異也可能是由于不同牛脂肪酸的組成不同造成。研究表明，安格斯牛與日本和牛皮下脂肪和肌間脂肪的氨基酸組成不同[12]。以前研究報道表明FASN在脂肪型個體表達量高于瘦肉型個體[14]。這些研究結果表明脂肪酸的組成與動物的品種有關，同時與脂肪蓄積過程相關。FASN在延黃牛皮脂中的表達量顯著高于延邊黃牛，而在腹部脂肪和腎周脂肪中差異不顯著，說明延黃牛是由延邊黃牛選育而成，這2個品種有相同的遺傳基礎。

4結論

在延邊黃牛和延黃牛2個不同牛品種中，F(xiàn)ASN 基因mRNA在不同脂肪組織中的表達量均高于背最長肌，而延黃牛中FASN基因mRNA在皮下脂肪、腹部脂肪表達量均顯著高于腎周脂肪和背最長肌。通過對其他器官的研究發(fā)現(xiàn)，肺中FASN因mRNA的表達量高于其他臟器，在小腸、心臟、肝臟和腎臟中表達量微弱。這說明FASN是影響脂肪酸合成的關鍵酶，與肉質相關，其中皮下脂肪和腹部脂肪是脂肪酸合成的主要部位。

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摘要為了探討不同品種牛不同脂肪沉積部位FASN基因mRNA表達水平與肉質的關系，采用熒光定量PCR技術檢測延邊黃牛和延黃牛皮下脂肪、腹部脂肪、腎周脂肪與其他器官的FASN基因mRNA表達水平。結果表明，2個牛品種的FASN基因mRNA在不同脂肪組織中表達量均高于背最長肌，而延黃牛皮下脂肪和腹部脂肪中FASN基因mRNA表達量都高于延邊黃牛。通過對肺、小腸、腎臟、肝臟和心臟中FASN基因mRNA研究發(fā)現(xiàn)，延邊黃牛和延黃牛肺中FASN基因mRNA的表達量高于其他臟器。由此可見，F(xiàn)ASN是影響脂肪酸合成的關鍵酶，與肉質相關，其中皮下脂肪和腹部脂肪是脂肪酸合成的主要部位。

關鍵詞延邊黃牛；延黃牛；脂肪組織；FASN基因；熒光定量PCR

mRNA Expression Levels of FASN Gene in Various Adipose Tissues from Yanbian Yellow Cattle and Yanhuang Cattle and Its Association with Meat Quality

GONG Qiang, MENG Ying, MA Wen-xiu, JI Shuang*et al(College of Agriculture, Yanbian University, Yanji, Jilin 133000)

AbstractThe objective of this study was to investigate the correlation between cattle breed and deposit of adipose tissues in different position and the mRNA expressions levels of fatty acid synthase (FASN), which are associated with meat quality. To understand this difference, the expression of FASN in different adipose tissues in these two breeds were analyzed using Real-time quantitative polymerase chain reaction method. The result showed that FASN mRNA expression levels was significantly higher in adipose tissue than in LD in both breeds. On the other hand, FASN mRNA expression levels in subcutaneous fat and abdominal fat in Yanhuang cattle were significantly higher than that in Yanbian yellow cattle. Furthermore, the mRNA expression levels of FASN gene in lung, colon, kidney, liver, heart of Yanbian yellow cattle and Yanhuang cattle were also investigated. The results showed that the highest mRNA expression levels of FASN gene were detected in the lung in both breeds. FASN as a critical enzyme in biosynthesis of fatty acids is associated with meat quality, subcutaneous fat and abdominal fat is a critical part in biosynthesis of fatty acids.

Key wordsYanbian yellow cattle; Yanhuang cattle; Adipose tissues; FASN; qRT-PCR

收稿日期2015-04-30

通訊作者

作者簡介宮強(1990-)，男，吉林長春人，本科生，專業(yè)：動物科學。*，講師，博士，碩士生導師，從事分子遺傳與動物育種研究。

基金項目吉林省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目。

中圖分類號S 823.8+1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-153-03